17型コラーゲンは複数のシグナル伝達経路を介して膵癌の腫瘍形成を制御する

概要

博⼠論⽂

17 型コラーゲンは複数のシグナル伝達経路を介して膵癌の腫瘍形成を制御する

東北⼤学⼤学院医学系研究科医科学専攻
外科病態学講座消化器外科学分野
柏⽊

良介

⽬次

1. 要約........................................................................................................................ 2
2. 研究背景................................................................................................................. 4
3. 研究⽬的................................................................................................................. 7
4. 研究⽅法................................................................................................................. 8
5. 研究結果............................................................................................................... 17
6. 考察...................................................................................................................... 27
7. 結論...................................................................................................................... 33
8. 謝辞...................................................................................................................... 34
9. ⽂献...................................................................................................................... 35
10. 図の説明............................................................................................................... 41
11. 図.......................................................................................................................... 47
12. 表.......................................................................................................................... 56

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1. 要約

癌組織における 17 型コラーゲンの発現量は、癌種に応じて患者の⽣存率低下または
⽣存率の改善と相関があることが報告されている。しかし、この癌種依存的な 17 型
コラーゲンによる癌の進⾏制御のメカニズムはほとんど知られていない。本研究で
は、膵癌細胞株を⽤いて in vitro の細胞増殖、抗癌剤感受性、および in vivo での腫
瘍形成において 17 型コラーゲンがどのような影響を⽰すか調べた。公共データベー
スに登録されている膵癌組織の単⼀細胞 RNA sequencing データを解析し、17 型コ
ラーゲンは主に癌細胞で発現しており、周囲の間質細胞では発現していないことを
明らかにした。術前化学療法後の膵癌組織の遺伝⼦発現量解析では、抗癌剤耐性の
⾼い患者群で 17 型コラーゲンの発現量が有意に上昇しており、17 型コラーゲンの
抗癌剤耐性への関与が⽰唆された。膵癌細胞株で 17 型コラーゲンを過剰発現して
も、in vitro では細胞の増殖速度や抗癌剤感受性に影響を与えなかった。しかしなが
ら、膵癌細胞株と同じ遺伝的背景を持つ C57BL/6 または FVB マウスを⽤いた in
vivo の腫瘍形成実験の結果、C57BL/6 では 17 型コラーゲンの過剰発現は腫瘍の成
⻑を促進する⼀⽅で、FVB マウスでは抑制した。マウスから摘出した腫瘍組織の
RNA sequencing 解析によって、17 型コラーゲンの過剰発現は免疫応答経路、Wnt
シグナル伝達経路、および Hippo シグナル伝達経路に関連する遺伝⼦の発現に影響
を与えていた。さらに、17 型コラーゲンの発現によって、FVB マウスではナチュラ
ルキラー細胞の腫瘍組織への浸潤が促進するが、C57BL/6 マウスでは促進していな

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かった。これらの解析結果から、17 型コラーゲンは、癌細胞と腫瘍微⼩環境の相互
作⽤を通して、癌の進⾏を「促進」または「抑制」することが⽰唆された。

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2. 研究背景

膵癌は最も予後の悪い癌種の１つであり、5 年⽣存率は 8-10%程度と極めて低い 13)

。無症状で経過するため診断時には根治切除可能な症例は２割程度しかなく 1)、⼿

術後の再発率も⾼い 4)ため治癒率向上のためには補助療法の開発が必要不可⽋であ
る。近年、東北⼤学が中⼼的実施医療機関として⾏った多施設共同臨床試験により
切除可能膵癌に対する術前補助化学療法 (Neoadjuvant chemotherapy: NAC) の有⽤
性が⽰され 5)、術後補助化学療法とともに標準治療となった 6, 7)。しかしながら、
NAC が奏功する患者群が存在する⼀⽅で、NAC が効果を⽰さない患者群がいるこ
とも明らかとなり、その層別化因⼦は不明である。膵癌の抗癌剤耐性の研究報告は
幾つかあるが 8-10)未だメカニズムは不明な点が多く、NAC が奏功する患者群と有効
でない患者群を判別する因⼦を特定することは術前の治療⽅針の決定や予後予測に
⾮常に⼤きな意味を持つ。
腫瘍組織は、腫瘍細胞とその周囲に存在する免疫細胞、⾎管内⽪細胞、線維
芽細胞、およびそれらの細胞から分泌される細胞外マトリクスなどの腫瘍微⼩環境
で構成されている 11)。腫瘍微⼩環境は腫瘍形成に⾮常に重要な役割を果たしてお
り、腫瘍細胞とその周囲の⾮腫瘍細胞や細胞外マトリクスとの相互作⽤は腫瘍の成
⻑、浸潤や転移の制御に関与している。前述のように膵癌は最も予後の悪い癌種で
あるが、その原因の⼀部は膵癌に特徴的な腫瘍微⼩環境に起因している可能性があ
る 12, 13)。特に膵癌の免疫抑制的な腫瘍微⼩環境は、癌細胞が免疫反応から逃れるこ

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とを可能としている 14)。また、膵癌組織に⾒られる過剰な癌関連線維芽細胞と細胞
外マトリクスは癌細胞の上⽪間葉転換や抗癌剤耐性に寄与していることが報告され
ている 8)。すなわち、腫瘍微⼩環境は膵癌を含む様々な癌種の抗癌剤耐性に関与し
ており、今後の癌治療の標的として注⽬されている 15, 16)。
17 型コラーゲン (遺伝⼦名: COL17A1) は膜貫通型タンパク質であり、上⽪
細胞と基底膜をつなぐ細胞接着因⼦ヘミデスモゾームの構成因⼦としてよく研究さ
れている 17, 18)。ヘミデスモゾームでは、17 型コラーゲンはインテグリンα6β4 と共
に細胞外マトリクスであるラミニン 332 と結合することで、上⽪細胞を基底膜に安
定につなぎとめている。特に表⽪において 17 型コラーゲンは細胞接着因⼦として⼤
きな役割を果たしているため、⽪膚疾患領域で数多くの研究がなされている。具体
的には、17 型コラーゲンの機能喪失による重度の⽔疱性⽪膚疾患や、17 型コラーゲ
ンに対する⾃⼰抗体の出現による⽔疱性類天疱瘡、また COL17A1 遺伝⼦の変異が
接合部型表⽪⽔疱症における疾患の発症に関わっていることがわかっている 19)。
腫瘍組織における COL17A1 の発現変化は様々な癌種で観察されており、膵
癌においても診断・予後規定因⼦・バイオマーカーとして利⽤できる可能性が報告
されている 20-22)。しかし、癌の進⾏における 17 型コラーゲンの役割は複雑であり、
癌種によってその働きが異なるため、未だ⼀定の⾒解は得られていない 17)。たとえ
ば、膵癌細胞における COL17A1 の過剰発現は in vitro で細胞の増殖を「亢進さ
せ」、免疫不全マウスでの腫瘍成⻑を「促進する」という報告がある⼀⽅で、浸潤性

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乳癌では癌細胞の増殖を「抑制する」という報告がある 23, 24)。さらに、COL17A1
の発現は⼤腸癌や扁平上⽪癌では細胞浸潤を「促進する」ことが報告されている
が、膵癌や浸潤性乳癌では細胞の移動と浸潤を「抑制する」ことが報告されている
25-28)

。これらの観察結果は、17 型コラーゲンが癌の進⾏・転移の「促進」と「抑

制」のどちらにも働き得ることを⽰しているが、そのメカニズムは未だ解明されて
いない。本研究では、膵癌細胞の腫瘍形成における 17 型コラーゲンの役割とメカニ
ズムを、特に免疫細胞を含む腫瘍微⼩環境との関連において検討した。

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3. 研究⽬的

本研究の⽬的は、膵癌における 17 型コラーゲンの役割を明らかにすることである。
ヒトの各種癌組織の RNA-sequencing データおよびヒト膵癌組織の単⼀細胞 RNA
sequencing データを解析することにより、膵癌における 17 型コラーゲンの発現の
臨床的意義を明らかにする。また、17 型コラーゲンの発現を制御した膵癌細胞株を
⽤いて、細胞増殖能、抗癌剤感受性、および腫瘍形成能を解析し、これらの機能に
17 型コラーゲンがどのように関与するかを検証する。

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4. 研究⽅法
癌組織の RNA-sequencing データの解析

各種癌組織における RNA-sequencing (RNA-seq) 解析および全⽣存期間 (Overall
survival: OS) の解析には、The Cancer Genome Atlas (TCGA) と The GenotypeTissue Expression (GTEx) のデータセットを⽤いた。COL17A1 mRNA の発現量デ
ータ (RSEM-TPM ファイル; RSEM ソフトウェアによって計算された転写産物 100
万リードあたりの転写産物量データ、transcript per million: TPM) と OS ファイル
は、UCSC Xena（https://xena.ucsc.edu/, University of California at Santa Cruz,
Bethesda, CA, USA）からダウンロードした 29)。OS 解析では、対象患者を

COL17A1 mRNA 発現量が中央値より⾼い群と中央値以下の 2 群に分類し、R
software version 4.0.3 の EZR version 1.54 パッケージを使⽤して解析した。

膵癌組織の単⼀細胞 RNA-sequencing データの解析

膵癌組織の単⼀細胞 RNA-sequencing (sc-RNA-seq)には、National Center for
Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) に公開されて
いるデータセット (GSE155698) を⽤いた 30)。15 個の原発腫瘍のデータを統合し、
R software の Seurat パッケージを使⽤して解析した 31)。細胞タイプの識別には、
Steele らの細胞マーカーを使⽤した 30)。

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細胞培養

ヒト膵癌細胞株である PANC-1 (RRID: CVCL_0480)、MIA PaCa-2 (RRID:
CVCL_0428)、AsPC-1 (RRID: CVCL_0152) は理研バイオリソースセンター
(Ibaraki, Japan)から⼊⼿した。マウス膵癌細胞株である KPC (KrasG12D, Tp53R172H,
C57BL/6 mouse background) と AK4.4 (KrasG12D, Tp53+/−, FVB mouse background)
は Massachusetts General Hospital の Dr. Dan G Duda の研究室より譲渡された。
PANC-1、MIA PaCa-2、KPC、AK4.4 は DMEM 培地 (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA)を⽤いて培養し、AsPC-1 は RPMI 1640 培地 (Sigma-Aldrich) を⽤いて
培養した。全ての培地には⾮働化した 10%ウシ胎児⾎清 (Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, USA) を加え、37℃、5% CO2 に調整した加湿環境で細胞を培養し
た。また、全ての細胞でマイコプラズマ感染がないことを確認し、実験を⾏った。
※RRID: Research Resource Identifier (研究資源識別⼦)

17 型コラーゲンの過剰発現およびノックアウト細胞の作製

17 型コラーゲンを膵癌細胞株に過剰発現させるためにレンチウイルスベクター
CSII-EF-MCS-IRES-Puro を⽤いた。ヒト膵癌細胞株である PANC-1 と MIA PaCa-2
には、ヒト COL17A1 をコードした遺伝⼦組み換えレンチウイルスを感染させた。
同様に、マウス膵癌細胞株である KPC と AK4.4 にはマウス Col17a1 をコードした
遺伝⼦組み換えレンチウイルスを感染させた。感染した細胞を 5 µg/ml puromycin

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(Sigma-Aldrich) を含む培地で選択培養した。KPC および AK4.4 については限界希
釈法により単⼀細胞クローンを樹⽴し、PANC-1 および MIA PaCa-2 はポリクロー
ナル集団として解析に⽤いた。また、各種細胞に⽬的遺伝⼦をコードしないレンチ
ウイルスを感染させることで、空ベクターを導⼊した対照細胞を作製した。
AsPC-1 における COL17A1 遺伝⼦のノックアウトでは、COL17A1 を標的
とするガイド RNA（gRNA）および Cas9 タンパク質をコードするプラスミド
pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0（RRID: Addgene_62988）を使⽤した。
Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) を⽤いて AsPC-1 にプラスミドを導
⼊し、15 µg/ml puromycin (Sigma-Aldrich) を含む培地で 2 ⽇間選択培養した後、限
界希釈法により単⼀細胞クローンを得た。gRNA の配列を表 1 に⽰す。

免疫染⾊

KPC と AK4.4 の免疫蛍光染⾊では、細胞を 4%ホルムアルデヒド溶液で固定し、抗
Col17a1 抗体 (ab184996, Abcam, Cambridge, UK) を⽤いて染⾊した。免疫複合体は
Alexa Flour 594 標識⼆次抗体 (Thermo Fisher Scientific) を⽤いて検出し、核を 4',6diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich) で対⽐染⾊した。
腫瘍組織の免疫染⾊では、ホルマリン固定パラフィン包理 (formalin fixed
paraffin embedded: FFPE) 検体から厚さ 3.5μm のパラフィン切⽚を作製し、各種⼀
次抗体を⽤いて染⾊した。⼀次抗体には、抗 Col17a1 抗体 (ab184996, Abcam)、抗

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Cxcl10 抗体 (10937-1-AP, Proteintech, Rosemont, IL, USA)、および抗 Ncr1 抗体
(ab233558, Abcam) を使⽤した。Col17a1 の免疫複合体はペルオキシダーゼ標識⼆
次抗体により 3,3ʹ-diaminobenzidine (Simple stain mouse MAX-PO Kit, Nichirei
Bioscience, Tokyo, Japan) を発⾊させることで検出し、ヘマトキシリンで核を対⽐染
⾊した。Cxcl10 と Ncr1 の免疫複合体は Alexa Flour 546 標識⼆次抗体 (Thermo
Fisher Scientific) を⽤いて検出し、DAPI (Sigma-Aldrich) で対⽐染⾊した。染⾊後
のサンプルは BZ-9000 顕微鏡 (Keyence, Osaka, Japan)、BX-51 顕微鏡 (Oympus,
Tokyo, Japan)、レーザー⾛査型共焦点顕微鏡 (Dragonfly, Andor and LSM980 with
Airyscan2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) で観察した。

ウエスタンブロット

細胞を Protein Lysis Buffer に懸濁し、15000 rpm、4℃で 10 分間遠⼼分離して、上
清を回収した。Protein Lysis Buffer の組成は以下の通りである。50 mM Tris-HCl
(pH 7.4)、300 mM NaCl、0.5% Triton X-100、aprotinin (2 µg/ml)、leupeptin (2
µg/ml)、1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride、400 µM Na3VO4、400 µM EDTA、
10 mM NaF、10 mM sodium pyrophosphate。サンプルに 2× SDS Sample Buffer
[50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、2% SDS、10% glycerol、5% 2-mercaptoethanol] を加
えて、95℃で 4 分間熱変性した。サンプルを 6-10%のポリアクリルアミドゲル電気
泳動 (SDS-PAGE) により分離した後、polyvinylidene difluoride 膜 (Millipore,

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Billerica, MA, USA) に転写し、5%スキムミルクを⽤いてブロッキングを⾏った。⼀
次抗体には抗 Col17a1 抗体 (ab184996, Abcam) と抗β-actin 抗体 (3700, Cell
Signaling Technology, Danvers, MA, USA) を使⽤し、免疫複合体は horseradish
peroxidase 標識⼆次抗体 (Promega, Madison, WI, USA) および Super Signal West
Substrate (Thermo Fisher Scientific) を⽤いて検出した。化学発光シグナルは
ChemiDoc Touch デジタルイメージングシステム(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) を⽤
いて検出した。

In vitro 細胞増殖アッセイ

KPC と AK4.4 の細胞増殖アッセイでは、60 mm ディッシュ１枚あたり 1.0 × 105 個
の細胞を播種し、2 ⽇毎に⾃動セルカウンター (BioRad) で細胞数を測定した。
Population doubling level (PDL) は以下の式にしたがって計算した。
ΔPDL = 3.322[log(Y) - log(I)]
Y は増殖期間終了時の細胞数、I は播種した細胞数である。PANC-1、MIA PaCa2、および AsPC-1 は、96 ウェル平底プレート（Corning, Corning, NY, USA）1 ウ
ェルあたり 1 × 104 個の細胞を 100μl の培地に懸濁して播種し、Cell Counting Kit8 (CCK8, Dojindo, Kumamoto, Japan) を⽤いて１⽇毎に相対細胞数（450 nm にお
ける吸光度）を測定した。

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nCounter Analysis System によるヒト膵癌組織の遺伝⼦発現量解析

東北⼤学消化器外科学分野において 2006 年から 2016 年の間に NAC 後に根治切除
を⾏った膵癌症例のうち、NAC が奏功した患者群 (NAC-effective: NAC-E) 13 例と
NAC が効かなかった患者群 (NAC-noneffective: NAC-N) 13 例を解析した。NAC-E
と NAC-N は病理組織学的治療効果判定 Evans 分類に基づいて判断し、Evans 分類
Grade 2b 以上を NAC-E、Evans 分類 Grade 1 以下を NAC-N と定義した。遺伝⼦発
現量解析では、膵がん組織の FFPE 検体を nCounter Analysis System (Nanostring
Technologies, Seattle, WA, USA) を⽤いて解析した。臨床検体の使⽤および解析につ
いては, 東北⼤学⼤学院医学系研究科倫理委員会の承認のもとで⾏なった (承認番号
2020-1-264、膵胆道疾患におけるオミックス解析による新規治療標的の検索：多施
設共同後⽅視的探索研究)。

抗癌剤感受性試験

96 ウェル平底プレート（Corning）1 ウェルあたり AK4.4 は 2.5 × 103 個、MIA
PaCa-2 と AsPC-1 は 5 × 103 個の細胞を 100μl の培地に懸濁して播種し、24 時間
後に Gemcitabine hydrochloride (G1745, LKT Laboratories, St.Paul, MN, USA) また
は 5-Fluorouracil (F6627, Sigma-Aldrich) を投与した。薬剤を投与してから 72 時間
培養し、CCK8 (Dojindo) を⽤いて相対細胞数（450 nm における吸光度）を測定し
た。相対細胞数から各薬剤濃度における細胞⽣存率を計算し、GraphPad Prism 9

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version 9.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) を⽤いて細胞⽣存曲線およ
び 50%阻害濃度 (half maximal inhibitory concentration: IC50)を算出した。 ...

この論文で使われている画像