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新規 in vitro エピジェネティック毒性評価システムの構築に向けた基盤研究

大塚 まき 東北大学

2021.03.25

概要

エピジェネティクスは、近年、病気や体質を構成する様々な要因の1つとして注⽬されており、その機構はDNA配列の変化無しにDNAやヒストンへの化学修飾を介して形質を変化させることを特徴とする（Cavalli and Heard, 2019）。CAS（Chemical Abstracts Service）に登録されている化学物質は1億種類以上あり、その数は年々増加している(Ideta-Otsuka et al., 2017）。このような多種多様な化学物質の安全性評価は、基本的に数種類の遺伝毒性試験と⼀般毒性試験からなり毒性プロファイルの判定に基づく規制により⼗分に管理されている。しかし、中には、従来の毒性試験では毒性が検出されなかった化学物質において、⽣涯に影響が残るものや胎児への影響を⽰す可能性が報告されているものも報告され始めている。このように、化学物質の作⽤によりエピジェネティックな制御の乱れが疾患と密接に関係している事例が報告されており、それに伴う毒性の影響が懸念されている。すなわち、化学物質がエピジェネティックな制御を破壊して毒性を発揮する「エピジェネティック毒性」という新しい概念を考える必要性が指摘されている（Marczylo et al., 2016；Ideta-Otsuka et al., 2017）。実際、⽇本毒性学会、⽶国毒性学会・関連学会のシンポジウムや⽣涯教育講習会などでトピックとして取り上げられ、毒性学の教科書などにもエピジェネティック毒性研究の重要性と必要性が取り上げられ注⽬されている。

　この問題に対応するためには、エピジェネティック毒性物質の同定のためにスクリーニング⼿段を確⽴することが重要であると考えた。なぜなら、DNAメチル化やヒストン修飾は、エピジェネティックな制御の鍵となるプロセスであることが知られており、細胞内で起こっているエピジェネティックな状態を解析するためには、様々な複雑な⽣化学的⼿法を⽤いる必要がある。例えば、DNAメチル化の検出には重亜硫酸処理が必要で（Liand Tollefsbol, 2011）、ヒストン修飾の検出にはクロマチン免疫沈降法が必要であり（Heintzman et al.）これらの実験⼿法は従来の毒性試験とは相容れないものである。そのため、エピジェネティックな毒性を持つ化学物質の同定が進んでおらず、エピジェネティック作⽤を持つ化学物質の報告も進んでいない。今後、簡便な検出法を開発することで、エピジェネティック作⽤を持つ化学物質の同定を進める必要がある。

　そこで本研究では、定量的に測定可能なルシフェラーゼをレポーターとし、DNAメチル化度の異なる2種類のプロモーターをターゲットプロモーターとして⽤い、DNAメチル化の増加と減少の両⽅を検出するレポーターシステムをさらに構築し、化学物質のDNAメチル化への影響を評価するためのプロトタイプシステムを作成した。具体的には、このシステムの妥当性や有効性を⾒るために、化学物質のDNAメチル化効果を検出できるかどうかを調べ、DNA脱メチル化活性を有することが知られている5-アザシチジン（5-azaC）を⽤いて、化学物質のDNA脱メチル化活性の検出性を検討した（Okochi-Takada et al., 2018; Stresemann and Lyko, 2008）。また、次のステップとして、5-azaC活性の検出感度を⾼めるために、レポーターベクターを細胞に導⼊する前にメチラーゼで処理することにより、メチル化の基底レベルを⾼めることを試みた。本論⽂では、新しいアッセイシステムの構築とそれに伴うデータを⽰すとともに、この研究により化学物質のDNAメチル化影響を簡便に検出する評価システムの確⽴を⽬的とした。

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参考文献

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