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循環器領域における GPCR リガンド探索のための新規高感度アッセイ系の確立

木戸, 命 東京大学 DOI:10.15083/0002005051

2022.06.22

概要

Gタンパク質共役型受容体（GPCR）は、細胞膜上に存在する7回膜貫通型の受容体分子群である。GPCRにリガンドが結合するとGPCRに構造変化が生じ、共役する三量体Gタンパク質が活性化され下流にシグナルが伝達される。GPCRは創薬ターゲットとして適した分子群であり、実際に現在上市されている医薬品の約4割はGPCRをターゲットとしている。循環器疾患領域においては、αアドレナリン受容体作動薬・拮抗薬、βアドレナリン受容体作動薬・拮抗薬、アンギオテンシン受容体拮抗薬、バソプレシン受容体拮抗薬など、GPCRを標的とした医薬品が多数開発されているが、これら既存の医薬品だけでは治療効果が不十分な疾患も存在する。そこでGPCRを介した未知の作用の中に、循環器疾患の病態生理に関わるものが未だ存在するとの作業仮説の下、新規GPCRリガンド探索を通じた革新的な治療薬開発が求められている。

GPCRと共役する三量体Gタンパク質はα、β、γの三つのサブユニットにより複合体を形成する。Gαサブユニットはそのアミノ酸配列の違いによりGαs、Gαi/o、Gαq/11、Gα12/13の四種類に大別され、それぞれ活性化する下流のシグナルが異なる。なかでも、心血管系におけるGα12/13シグナルが近年注目されており、マウスにおいてGα13をコードする遺伝子を破壊すると内皮細胞が血管形成に寄与できなくなり胎生致死を引き起こすこと、圧負荷によって誘導される心筋肥大と心臓の線維化が心臓特異的Gα13ノックアウトマウスにおいて抑制されること、などが報告されている。

GPCRリガンド探索の際には、標的とするGPCRがどのGαに共役するかをあらかじめ知り、そのGαシグナルに対応するアッセイ系を用意する必要がある。Gα12/13シグナルを検出できるアッセイ系は現時点で既にいくつか知られているものの、ハイスループットスクリーニングに対応可能な簡便で高感度なアッセイ系は存在しない。よって、この課題を解決する新規アッセイ系を開発すれば、Gα12/13に共役するGPCRを標的とした新規リガンド探索を効率化・加速化できる。

そこで本研究では、Gα12/13シグナルに対する簡便・高感度なアッセイ系を開発するために、まず「Gα12/13シグナルを増幅する人工遺伝子回路」をゲノム内に組み込んだアッセイ用ゲノム改変細胞の樹立を目指した。培養細胞（HeLa細胞）に、Gα12/13と特異的に共役するGPCRであるGPR55を一過性に発現させ、GPR55を活性化するリガンドで1時間刺激した。刺激前後の細胞からそれぞれ回収したmRNAを、次世代シークエンサーによるRNAseq解析にかけ、GRP55-Gα12/13シグナルの活性化によって発現量が有意に増加する遺伝子群を網羅的に同定した。またこれと同様の実験を、Gα12/13と特異的に共役する異なるGPCR（LPAR6）を用いても実施した。この二つの実験によりそれぞれ同定された遺伝子群の中で、①刺激前後で遺伝子発現量が5倍以上増加、②刺激前の遺伝子発現量がFPKM（fragments per kilobase of exon per million reads mapped）値で10以上、の二条件を満たす遺伝子はNR4A1とCTGFのみであった。

次に、Gα12/13シグナルを細胞内で増幅することを目的に、①「NR4A1の転写調節機構」によって「プロテアーゼ切断領域を有する細胞膜型人工転写因子」の発現が直接制御され、②「CTGFの転写調節機構」によって「プロテアーゼ」の発現が直接制御されるような人工遺伝子回路を設計し、それを上記RNAseq実験で使用したHeLa細胞のゲノムに組み込むことを計画した。この人工遺伝子回路が組み込まれたHeLa細胞では、Gα12/13が活性化されると「NR4A1の転写調節機構」が活性化され、「プロテアーゼ切断領域を有する細胞膜型人工転写因子」が発現する。発現した人工転写因子は細胞膜に結合するのでこのままでは不活性型となる。一方、Gα12/13が活性化されると「NR4A1の転写調節機構」の活性化と独立・並行して「CTGFの転写調節機構」も活性化されるため、その下流で「プロテアーゼ」が発現する。発現したプロテアーゼは、人工転写因子に連結されているプロテアーゼ切断領域に作用して転写因子を細胞膜から切り離し、切り離された転写因子（遊離型転写因子）は、核内へと移行し活性型となる。このように本細胞においては、「プロテアーゼ切断領域を有する細胞膜型人工転写因子」を基質、「プロテアーゼ」を酵素、「遊離型転写因子」を生産物、とする酵素反応がGα12/13シグナル依存的に開始される。この酵素反応を反応初期の単純化したモデルで捉えれば、生産物の量（遊離型転写因子の量）は、基質である「プロテアーゼ切断領域を有する細胞膜型人工転写因子」の細胞内濃度と、酵素である「プロテアーゼ」の細胞内濃度の積に比例する。また、あらかじめ「遊離型転写因子によりレポーター遺伝子が発現誘導されるコンストラクト」を設計し、それを上記細胞に遺伝子導入しておけば、遊離型転写因子の量（酵素反応の生産物の量）は、レポーター遺伝子の発現量を指標に定量的に検出することができる。すなわち、この人工遺伝子回路が組み込まれたHeLa細胞を用いることにより、Gα12/13の活性化状態は「NR4A1の転写調節機構」および「CTGFの転写調節機構」の活性化度合いの積へと変換され、最終産物であるレポーター遺伝子の発現量を発光などによって定量すれば、相乗的に増幅された出力を得ることができる。

上記コンセプトの細胞を樹立するために、まず①「プロテアーゼ切断領域を有する細胞膜型人工転写因子」をコードするDNA配列の5’上流にIRES配列を付加したDNAカセットを作製し、このカセットをHeLa細胞ゲノムのNR4A1遺伝子座3’UTRにCRISPR-Cas9システムを用いてノックインした。引き続き②「プロテアーゼ」をコードするDNA配列の5’上流にIRES配列を付加したDNAカセットを作製し、このカセットをCTGF遺伝子座3’UTRにノックインした。このように、HeLa細胞の二つの異なる遺伝子座にゲノム改変（上記①および②のノックイン操作）を加えることで、「Gα12/13シグナルを増幅する人工遺伝子回路」がゲノムに組み込まれた細胞（アッセイ用ゲノム改変細胞）を樹立した。

この細胞を利用した新規アッセイ系は以下の極めて簡便な手順で実施される：「試験対象となるGPCRを発現するコンストラクト」および「遊離型転写因子によりレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）が発現誘導されるコンストラクト」をアッセイ用ゲノム改変細胞に同時にトランスフェクションする。トランスフェクションから24時間後に細胞を被験物質により刺激し、6時間刺激後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定する。

Gα12/13と共役するGPCRであるGPR55とLPAR6を用いて、この新規アッセイ系と従来のアッセイ系を比較した。従来の方法ではリガンド刺激に対する応答がほとんど見られなかったこれら二つのGPCRに対して、新しいアッセイ系では共に40倍以上のS/B比（signal/back ground ratio）が得られたことから、新たなアッセイ系は目的通りにGα12/13を介したシグナルの高感度な検出を可能にすることが確かめられた。

次に、Gα12/13以外のGαと共役するGPCR、すなわちGαsと共役するADORA2A、Gαi/oと共役するOPRM1、Gαq/11と共役するHRH1についても本アッセイ系で検討したところ、いずれの受容体に対しても良好な容量反応曲線を得ることができた。この結果は、Gα12/13の下流で活性化される遺伝子であるNR4A1およびCTGFが、Gα12/13以外のGαの下流においても程度の差こそあれ活性化されることを示唆している。よって本アッセイ系は、当初期待されていたGα12/13を介したシグナルだけでなく、Gαs、Gαi/o、Gαq/11を介したシグナルまでも広くカバーする網羅性・汎用性を有する可能性がある。そこで、本アッセイ系のGPCRに対する網羅性・汎用性を、リガンド既知のヒトGPCR全て（218種）を対象としてさらに検討したところ、186受容体にて良好な容量反応曲線を得ることができた（カバー率90%）。

以上の実験結果は、本アッセイ系がGα12/13と共役するGPCRのリガンド探索のみならず、オーファンGPCR（内因性リガンドが不明のGPCR）のリガンド探索にも適していることを示唆する。オーファンGPCRはリガンドが不明なためどのGαと共役するかをあらかじめ予測することは難しい。共役するGαの種類に依らず、同一のアッセイフォーマットで90%のGPCRの活性を評価できる本アッセイ系を用いれば、このオーファンGPCR特有のジレンマも解決できる可能性が高い。GPCR創薬分野において、①Gα12/13と共役するGPCRのリガンド探索、②オーファンGPCRのリガンド探索、はまだまだ未開拓の領域である。本アッセイ系の開発により、この二つの未開拓領域（GPCR創薬のブルーオーシャン）におけるGPCRリガンド探索の効率化・加速化が期待される。

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