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37
図の説明
Figure 1. SAS における EGFR の発現
(a) MS1,A431,SAS における EGFR 発現量を FACS により評価した。
(b) SAS 皮下移植モデルの腫瘍組織における EGFR の発現を組織免疫染色により
評価した (左図ルーペ像:Scale bar = 2.5mm 右図強拡大像(対物 100 倍 油
浸): Scale bar = 50μm )。
Figure 2. NIR-PIT 後 24 時間以内には腫瘍の縮小は認めなかった
(a) In vivo 実験 プロトコール
(b) 担癌マウスの近赤外線光照射前後におけるがん細胞由来蛍光シグナルの in
vivo イメージング装置 IVIS による検出画像
(c) NIR-PIT 後 24 時間以内の腫瘍体積の測定結果 (n=3~4)
(d) 異なる近赤外線光照射量による腫瘍体積の測定結果 (n=4)
38
Figure 3. NIR-PIT により腫瘍壊死領域は拡大した
(a) Control (非治療群)、近赤外線照射 0 時間後、1 時間後、6 時間後、24 時間後
の腫瘍の H E 染色像
左から腫瘍全体像 (赤線:腫瘍全体、黄線:壊死領域)、腫瘍部拡大像 (対物 40
倍, Scale bar:50μm)、壊死領域拡大像 (対物 40 倍, Scale bar : 50μm)
(b) 各群の経時的な腫瘍壊死領域の定量解析結果 (n=3~4)
全体の腫瘍面積に占める壊死領域面積の割合からグラフを作成した。
Figure 4. 近赤外線光照射量依存的に腫瘍壊死領域は拡大した
(a) Control (非治療群)、0J、50J、100J の近赤外線光を 1 回照射した群、100J の
近赤外線光を 2 回照射した群の腫瘍の H E 染色像
左から、腫瘍全体像 (赤線:腫瘍全体、黄線:壊死領域)、腫瘍部拡大像 (対物 40
倍, Scale bar:50μm)、壊死領域拡大像 (対物 40 倍, Scale bar : 50μm)
(b) 異なる近赤外線光照射量における腫瘍壊死領域の定量解析結果 (n=4)
全体の腫瘍面積に占める壊死領域面積の割合からグラフを作成した。
39
Figure 5. NIR-PIT により腫瘍血管は拡張した
(a) Control (非治療群)、近赤外線照射 0 時間後、1 時間後、6 時間後、24 時間後
の腫瘍の CD31 免疫組織染色像
左から各群の CD31 免疫染色像 (対物 40 倍, Scale bar : 50μm)、ルーペ像(赤線:
腫瘍全体、黄線:壊死領域、橙塗りつぶし:拡張血管分布領域):
(b) NIR-PIT 後の経時的な腫瘍血管面積の割合の定量解析結果 (n=3~4)
残存腫瘍面積に対する腫瘍血管面積の割合からグラフを作成した。
(c) 腫瘍部における拡張血管数の割合
残存腫瘍部の腫瘍血管の総数における拡張血管の割合からグラフを作成した。
Figure 6. NIR-PIT により腫瘍血管は拡張した
(a) Control (非治療群)、近赤外線光 0J、50J、100J を 1 回照射した群、100J を 2
回照射した群の CD31 免疫組織染色像
左から各群の CD31 陽性血管像(対物 40 倍, Scale bar : 50μm)、拡張血管分布領
40
域 (赤線:腫瘍全体、黄線:壊死領域、橙塗りつぶし:拡張血管分布領域 , Scale
bar : 2.5mm)
(b) NIR-PIT 後の経時的な腫瘍血管面積の割合の定量解析結果 (n=3~4)
残存腫瘍面積に対する腫瘍血管面積の割合からグラフを作成した。
(c) 腫瘍部の拡張血管数の割合
残存腫瘍部の腫瘍血管の総数における拡張血管の割合からグラフを作成した。
Figure 7. NIR-PIT 早期では腫瘍血管の性質に変化がなかった
(a) Control(非治療群)、近赤外線照射 0 時間後、1 時間後、6 時間後、24 時間後の
CD31、αSMA 免疫組織二重染色像 (対物 40 倍, Scale bar : 50μm、茶:CD31 陽性
領域 , 赤:αSMA 陽性領域)
左:拡張血管部 右:非拡張血管部
(b) NIR-PIT 後の経時的な腫瘍血管面積の割合の定量解析 (n=3~4)
位相差顕微鏡強拡大下 (対物 20 倍) において CD31 陽性血管周囲の αSMA 陽性
41
周皮細胞被覆率を4段階 (0-25% , 26-50% , 51-75% , 76-100%) に分け、それぞれの
血管数割合の平均値からグラフを作成した。
Figure 8. NIR-PIT 早期に腫瘍血管の性質に変化がなかった
(a) Control (非治療群)、近赤外線光 0J、50J、100J を 1 回照射した群、100J を 2
回照射した群の CD31、αSMA 免疫組織二重染色像 (対物 40 倍, Scale bar : 50μm、
茶:CD31 陽性領域 , 赤:αSMA 陽性領域)
左:拡張血管部 右:非拡張血管部
(b) NIR-PIT 後の腫瘍血管面積の割合の定量解析 (n=3~4)
位相差顕微鏡強拡大下 (対物 20 倍) において CD31 陽性血管周囲の αSMA 陽性
周皮細胞被覆率を4段階 (0-25% , 26-50% , 51-75% , 76-100%) に分け、それぞれの
血管数割合の平均値からグラフを作成した。
Figure 9. NIR-PIT 直後に腫瘍細胞に障害が生じた
(a) Control (非治療群)、近赤外線照射 0 時間後、1 時間後、6 時間後、24 時間後
の EGFR 免疫組織染色像 (対物 100 倍,油浸 , Scale bar : 50μm)
42
(b) Control (非治療群)、近赤外線光 0J、50J、100J を 1 回照射した群、100J を 2 回
照射した群の EGFR 免疫組織染色像 (対物 100 倍, 油浸 , Scale bar : 50μm)
Figure 10. NIR-PIT により経時的にマクロファージの集積が増加した
(a) Control (非治療群)、近赤外線照射 0 時間後、6 時間後、24 時間後の CD31 免
疫組織染色像 (拡張血管部、非拡張血管部、壊死部) (対物 40 倍, Scale bar :
50μm) 、CD68 免疫染色像 (拡張血管部、非拡張血管部、壊死部) (対物 40 倍,
Scale bar : 50μm)
(b) 腫瘍全体における CD68 陽性細胞数を総腫瘍面積で割り、平均値をグラフ化し
た(DUNNETT 検定:*P<0.05 vs control)
(c) 各群における拡張血管部、非拡張血管部、壊死部の CD68 陽性細胞密度の平
均値をグラフ化した (DUNNETT 検定:*P<0.05(vs 拡張血管 control), + P<0.05(vs
非拡張血管 control), ★P<0.05(vs 壊死部 control))
Figure 11. NIR-PIT によりマクロファージの集積が増加した
43
(a) Control (非治療群)、近赤外線光 0J、50J、100J を 1 回照射した群、100J を 2
回照射した群の CD31 免疫組織染色像 (拡張血管部、非拡張血管部、壊死部) (対
物 40 倍, Scale bar : 50μm)、CD68 免疫染色像 (拡張血管部、非拡張血管部、壊死
部) (対物 40 倍, Scale bar : 50μm)
(b) 腫瘍全体の CD68 陽性細胞数を総腫瘍面積で割った平均値をグラフ化した
(DUNNETT 検定:*P<0.05 vs control )
(c) 各群の拡張血管部、非拡張血管部、壊死部における CD68 陽性細胞密度の平均
値をグラフ化した ( DUNNETT 検定:*P<0.05(vs 拡張血管 control), + P<0.05(vs 非
拡張血管 control), ★P<0.05(vs 壊死部 control)) 44
Fig.1 SASの細胞膜にEGFRの発現を認めた
(a) FACS
Unstained
Isotype Ctrl
αEGFR-Ab
MS1 (negative ctrl)
A431 (positive ctrl)
SAS
(b) IHC EGFR
SAS IHC
Brown : DAB
( scale bar : 2.5mm )
( scale bar : 50 μm )
Fig.2 : NIR-PIT後24時間以内では腫瘍体積の減少は認めなかった
(a)
−1
Day
1h
6h
Pan-IR 700 (100μg i.v)
NIR light (J/cm2)
50 / 100J
Resected tumor
100J
(b) (c) (d)
(b) Fluoroesence Imaging
NIR-PIT
近赤外線光照射前
( Pan-IR700 i.v 24h )
Control
Pan-IR700 (−)
( c ) Tumor growth curve
5.5
5.5
4.5
4.5
Control
3.5
(h)
Control (No treatment)
(b)
NIR-PIT 100J 0h
(c)
NIR-PIT 100J 1h
(d)
NIR-PIT 100J 6h
(e)
NIR-PIT 100J 24h
(f)
NIR-PIT 0J day1
(g)
NIR-PIT 50J day1
(h)
NIR-PIT 100J×2 day1
NIR-PIT
近赤外線光照射後
( Pan-IR700 i.v 24h )
( d ) Tumor growth curve
2.5
腫瘍体積比
腫瘍体積比
( a, e-g )
(a)
100J 24h
1.5
Control
0J
3.5
50J
100J 24h
2.5
100J×2
1.5
−1
Pan-IR100
(Day)
−1
NIR 100J
Resected
tumor
Pan-IR100
NIR 100J
Resected
tumor
NIR100J
Resected
tumor
Fig.3 NIR-PITにより腫瘍壊死領域は拡大した
腫瘍部
(a)HE染色像
壊死部
Control
0h
1h
6h
24h
( scale bar : 2.5mm )
( scale bar : 50 μm )
( scale bar : 50 μm )
(b)腫瘍壊死領域 (%)
100
NIR-PIT
HE staining
Necrosis area × 100 (%)
腫瘍壊死領域割合
Control
90
80
70
60
50
40
30
(%)
20
Total tumor area
10
Control
0h
1h
6h
24h
Fig.4 照射量依存的に腫瘍壊死領域は拡大した
(a)HE染色像
腫瘍部
壊死部
Control
0J
50J
100J
100J×2
( scale bar : 2.5mm )
( scale bar : 50 μm )
( scale bar : 50 μm )
(b)腫瘍壊死領域 (%)
100
NIR-PIT
HE staining
Necrosis area × 100 (%)
腫瘍壊死領域割合
Control
90
80
70
60
50
40
30
(%)
20
Total tumor area
10
Control
0J
50J
100J 100J×2
Fig.5
NIR-PITにより腫瘍血管は拡張した
(a) IHC CD31
拡張血管領域
拡張血管
Control
腫瘍領域
壊死領域
拡張血管領域
0h
拡張血管:
管腔構造を成してIる血管
1h
• DOI: 10.1016/j.clinimag.2020.06.0
29
CD31陽性拡張血管数
/ CD31陽性血管数の割合を測定した
6h
24h
( scale bar : 50 μm )
(b)
100
90
(c) 腫瘍部の拡張血管割合
腫瘍部の血管面積
100
Control
90
NIR-PIT
80
拡張血管割合(%)
腫瘍血管面積割合(%)
80
( scale bar : 2.5mm )
70
60
50
40
30
20
10
Control
NIR-PIT
70
60
50
40
30
20
10
Control 0h
1h
6h
24h
Control
0h
1h
6h
24h
Fig.6 NIR-PITにより腫瘍血管は拡張した
(a) IHC CD31
腫瘍血管部
拡張血管領域
腫瘍領域
Control
壊死領域
拡張血管領域
0J
拡張血管:
管腔構造を成してIる血管
50J
• DOI: 10.1016/j.clinimag.2020.06.029
CD31陽性拡張血管数
/ CD31陽性血管数の割合を測定した
100J
100J×2
( scale bar : 2.5mm )
( scale bar : 50 μm )
(c)腫瘍部の拡張血管割合
(b) 腫瘍部の血管面積
NIR-PIT
Control
90
80
90
拡張血管割合(%)
腫瘍血管面積 / 残存腫瘍面積割合
100
100
70
60
50
40
30
80
60
50
40
30
20
10
10
0J
50J
100J 100J×2
Control
70
20
Control
NIR-PIT
Control 0J
50J
100J 100J×2
Fig.7 NIR-PIT早期に腫瘍血管の性質に変化がなかった
Wide tumor vessel
(a)
Non wide tumor vessel
αSMA:Red
CD31:Brown
Control
0h
1h
6h
24h
( scale bar : 50 μm )
( scale bar : 50 μm )
血管周皮細胞の被覆率
(b)
0 - 25%
100
90
80
26 - 50%
血管割合(%)
70
60
51 - 75%
50
40
76 - 100%
30
20
10
Control
0h
1h
6h
24h
Fig.8 NIR-PIT早期に腫瘍血管の性質に変化がなかった
Wide tumor vessel
(a)
Non wide tumor vessel
αSMA:Red
CD31:Brown
Control
0J
50J
100J
100J×2
( scale bar : 50 μm )
( scale bar : 50 μm )
血管周皮細胞の被覆率
(b)
0 - 25%
100
90
26 - 50%
80
血管割合(%)
70
60
51 - 75%
50
40
76 - 100%
30
20
10
Control 0J
50J
100J 100J×2
Figure 9 : NIR-PIT直後に腫瘍細胞に障害が生じた
(a)
(b)
Control
Control
0h
0J
1h
50J
6h
100J
24h
100J×2
: 核が消失した細胞
: EGFR陽性細胞膜欠損細胞
( scale bar : 50 μm )
( scale bar : 50 μm )
Fig.10 NIR-PITにより経時的にマクロファージの集積を認めた
(a) 血管部位におけるマクロファージの集積
control
CD31
NIR-PIT 24h
CD31
CD68
CD68
拡張血管部
非拡張血管部
壊死部
( scale bar : 100 μm )
(b) 腫瘍全体のCD68陽性細胞密度(c) 各部位のCD68陽性細胞の密度
Control
NIR-PIT
* P<0.05 (vs 拡張血管 control)
平均陽性細胞密度(個/mm2)
18
16
14
12
10
平均陽性細胞密度(個/mm2)
*P<0.05 ( vs control )
20
壊死部
非拡張血管
拡張血管
十 P<0.05 (vs 非拡張血管 control)
★ P<0.05 (vs 壊死部 control)
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
Control 0h
1h
6h
24h
Control 0h
1h
6h
24h
Fig.11 NIR-PITによりマクロファージの集積を認めた
(a) 血管部位におけるマクロファージの集積
NIR-PIT 50J
CD31
CD68
control
CD31
CD68
拡張血管部
非拡張血管部
壊死部
( scale bar : 100 μm )
(b) 腫瘍全体のCD68陽性細胞密度(c) 各部位のCD68陽性細胞の密度
Control
NIR-PIT
* P<0.05 (vs 拡張血管 control)
十 P<0.05 (vs 非拡張血管 control)
★ P<0.05 (vs 壊死部 control)
*P<0.05 ( vs control )
200
18
16
14
12
10
平均陽性細胞密度(個/mm2)
平均陽性細胞密度(個/mm2)
20
壊死部
非拡張血管
拡張血管
180
160
140
120
100
80
60
40
20
Control
0J
50J
100J 100J×2
Control
0J
50J
100J 100J×2
...