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Functional Reconstruction of Denervated Muscle by Xenotransplantation of Neural Cells from Porcine to Rat

佐伯, 総太 名古屋大学

2023.05.30

概要

主論文の要旨

Functional Reconstruction of Denervated Muscle by
Xenotransplantation of Neural Cells from Porcine to Rat
ブタからラットへの異種神経細胞移植による脱神経筋の機能再建

名古屋大学大学院医学系研究科
運動・形態外科学講座

総合医学専攻

手の外科学分野

(指導:今釜 史郎
佐伯 総太

教授)

【緒言】
神経損傷や神経変性疾患は脱神経による不可逆的な筋萎縮が問題になる。麻痺治療
を目的として、脊髄への神経幹細胞移植が国内外で盛んに行われているが有効な治療
法はいまだに確立していない。また、末梢神経をターゲットにした研究も以前から行
われており、一定の成果を上げている。今後の臨床応用に向けて、ブタ胎児由来神経
幹細胞をドナー細胞とした異種移植に注目した。本研究の目的は、ブタ胎児由来神経
幹細胞を免疫不全ラットの末梢神経内に移植し、その効果を評価することで神経幹細
胞の至適な採取時期や分離方法などの移植条件を検討することである。
【方法】
8 週齢のヌードラットの腓骨神経を大腿レベルで切断し、脱神経モデルラットを作
成した。1 週間後、7 頭の妊娠マイクロミニブタ(妊娠 22 日目が 3 頭、妊娠 27 日目が
2 頭、妊娠 45 日目が 2 頭)から子宮を摘出した。子宮内のそれぞれのブタ胎児の脊髄
から神経幹細胞を分離し、得られた細胞数に応じて脱神経モデルラットへ割り振り、
片側の腓骨神経の遠位断端へ移植した。その結果、妊娠 22 日目の神経細胞投与ラット
を 8 匹(E22 群)、妊娠 27 日目を 5 匹(E27 群)、妊娠 45 日目を 4 匹(E45 群)作成した。
神経細胞を含まない培地のみを移植したラット 5 匹を対照群とした。
細胞移植から 12 週間後、各群で電気生理学的評価を行った。細胞移植部位の腓骨神
経の遠位断端を露出させ、電気刺激装置(ニューロパック S 1、日本光電工業)を用い
て刺激を行い、前脛骨筋の複合筋活動電位(CMAP)を測定後、各群の足関節の背屈角
度を記録した。機能評価後、長母趾伸筋を採取し 4% PFA で灌流固定した。また、腓
骨神経を採取し、近位部と遠位部に分けた。細胞移植部位を含む腓骨神経の近位半分
を凍結包埋とし、腓骨神経の遠位半分を EPON 包埋とした。
腓骨神経の組織学的評価のため、抗 β3-チューブリン抗体、抗 GFAP 抗体で免疫染
色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。神経筋接合部の評価のため採取した長母趾伸筋を
スライドガラスで圧迫し、4% PFA で固定した。その後抗 β3 チューブリン抗体、抗
SMI-312 抗体、α- Bungarotoxin で染色し、共焦点顕微鏡を用いて観察した。EPON 包埋
した腓骨神経の遠位半分を薄切し、切片をトルイジンブルーで染色し光学顕微鏡で観
察した。そして、有髄軸索の数と面積を ImageJ/Fiji ソフトウェアを用いて測定した。
【結果】
電気生理学的評価では、E 22 群と E 27 群の CMAP の平均振幅はそれぞれ 1.47 mV
と 3.64 mV であった(図 1 a)。E 45 群と対照群の全ラットで振幅は 0 mV であった。い
ずれの群でも CMAP の振幅に有意差は認められなかった。E22 群では 8 匹中 4 匹、E27
群では 5 匹中 4 匹のラットで、腓骨神経の電気刺激により足関節の背屈運動が見られ
た。E45 群と対照群では 4 匹とも足関節の背屈運動は見られなかった。いずれの群も
足関節背屈角度に有意差はなかった(図 1 b)。
全ての移植群で細胞移植部位である腓骨神経断端が腫大していた(図 2 a)。一方、対

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照群では断端の腫大は認められなかった(図 2 b)。組織学的評価では、蛍光免疫染色で
全 て の 移 植 群 で 細 胞 移 植 部 位 の 末 梢 神 経 に β3- チ ュ ー ブ リ ン 陽 性 の ニ ュ ー ロ ン と
GFAP 陽性のアストロサイトが認められた(図 2 c)。また、E22 群と E27 群では再生さ
れた神経筋接合部を確認した(図 3 a)。E 45 群と対照群では、運動終板に到達した軸
索はなかった(図 3 b)。トルイジンブルー染色により、全ての移植群の腓骨神経に有髄
軸索の存在が確認された(図 4 a-d)。各群の有髄軸索数は E 27 群が最も多かったが、
群間差は有意ではなかった(図 4 e)。各群の有髄軸索の平均断面積は E 22 群で E 27 群
(p<0.01)および E 45 群(p<0.01)よりも有意に低かった(図 4 f) 。各群の有髄軸索径の
分布に有意な群間差はなかった(図 4 g)。
【考察】
本研究では、全ての移植群でブタ胎児由来の神経細胞がヌードラットの末梢神経内
に生着しており、髄鞘化された軸索を確認した。このことから、ブタ胎児由来神経細
胞が異種であるヌードラットの末梢神経内に生着することが示された。また、E22 群
と E27 群では、腓骨神経の電気刺激により足関節の背屈運動が見られた。胎児を採取
する時期によって移植成績に違いが見られ、神経幹細胞の至適な採取時期は妊娠 27 日
目に近いという事が示唆された。
ラットの胎児由来神経細胞を中枢神経系から切り離された末梢神経に移植する研
究は、Erb らが 1993 年に最初に報告した。同様の研究はこれまで他にマウスやヒトの
iPS 細胞を用いたものはあったが、ブタ胎児の神経細胞を異種の末梢神経に移植した
研究は初めてである。
ラットにおける胎児脊髄由来ニューロンの採取の最適な時期は、ニューロンへの分
化が最も進む妊娠 14 日目とされている。また、ラット胎児のドーパミン作動性ニュー
ロンも、妊娠 14 日目が移植に最適とされている。ブタの胎児のドーパミン作動性ニュ
ーロンの採取は、妊娠 26 日から 27 日目が最適とされる。これらの報告に基づくと、
ブタ脊髄由来ニューロンの最適な採取時期は妊娠 27 日目頃と予測され、これは今回
の実験結果と一致しており、妊娠 27 日目の細胞がニューロンへの分化が最も進んで
いることを示唆している。電気生理学的および組織学的評価の結果から、E 45 群のニ
ューロンは、生着し軸索伸長はしたが機能的な神経筋接合部を形成しないことを示し
た。
本研究の限界として、まずサンプル数が少ないことが挙げられる。より多くのサン
プルがあれば、胎児の妊娠期間の違いによる移植の効果の差がより明確にできたかも
しれない。また、今後の臨床応用のためには移植条件を検討しさらに改善する必要が
ある。Deshpande らは、末梢神経への神経栄養因子の投与が筋への軸索成長を促進す
ることを証明した。またいくつかの研究では、末梢神経内での運動ニューロンの生存
を改善する因子が調査されている。このような知見をふまえ、今後さらなる研究が必
要である。

-2-

【結論】
本研究では、ブタ胎児神経幹細胞の末梢神経への異種移植により脱神経筋の機能回
復が可能であることを示した。この技術を医療工学と組み合わせることで、麻痺の新
しい治療法の開発に役立つと考えられる。

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参考文献

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

Assinck, P.; Duncan, G.J.; Hilton, B.J.; Plemel, J.R.; Tetzlaff, W. Cell Transplantation Therapy for Spinal Cord Injury. Nat. Neurosci.

2017, 20, 637–647. [CrossRef]

Xu, X.; Shen, D.; Gao, Y.; Zhou, Q.; Ni, Y.; Meng, H.; Shi, H.; Le, W.; Chen, S.; Chen, S. A Perspective on Therapies for Amyotrophic

Lateral Sclerosis: Can Disease Progression Be Curbed? Transl. Neurodegener. 2021, 10, 29. [CrossRef]

Goutman, S.A.; Savelieff, M.G.; Sakowski, S.A.; Feldman, E.L. Stem Cell Treatments for Amyotrophic Lateral Sclerosis: A Critical

Overview of Early Phase Trials. Expert Opin. Investig. Drugs 2019, 28, 525–543. [CrossRef]

Gordon, T.; Tyreman, N.; Raji, M.A. The Basis for Diminished Functional Recovery after Delayed Peripheral Nerve Repair.

J. Neurosci. 2011, 31, 5325–5334. [CrossRef] [PubMed]

Sarhane, K.A.; Slavin, B.R.; Hricz, N.; Malapati, H.; Guo, Y.N.; Grzelak, M.; Chang, I.A.; Shappell, H.; von Guionneau, N.;

Wong, A.L.; et al. Defining the Relative Impact of Muscle versus Schwann Cell Denervation on Functional Recovery after Delayed

Nerve Repair. Exp. Neurol. 2021, 339, 113650. [CrossRef] [PubMed]

Vansteensel, M.J.; Pels, E.G.M.; Bleichner, M.G.; Branco, M.P.; Denison, T.; Freudenburg, Z.V.; Gosselaar, P.; Leinders, S.;

Ottens, T.H.; Van Den Boom, M.A.; et al. Fully Implanted Brain-Computer Interface in a Locked-In Patient with ALS. N. Engl.

J. Med. 2016, 375, 2060–2066. [CrossRef]

Slutzky, M.W. Brain-Machine Interfaces: Powerful Tools for Clinical Treatment and Neuroscientific Investigations. Neuroscientist

2019, 25, 139–154. [CrossRef] [PubMed]

Willett, F.R.; Avansino, D.T.; Hochberg, L.R.; Henderson, J.M.; Shenoy, K.V. High-Performance Brain-to-Text Communication via

Handwriting. Nature 2021, 593, 249–254. [CrossRef] [PubMed]

Lewis, M.; Rushanan, S. The Role of Physical Therapy and Occupational Therapy in the Treatment of Amyotrophic Lateral

Sclerosis. NeuroRehabilitation 2007, 22, 451–461. [CrossRef]

Gonzalez-Bermejo, J.; Morélot-Panzini, C.; Tanguy, M.L.; Meininger, V.; Pradat, P.F.; Lenglet, T.; Bruneteau, G.;

Forestier, N.L.; Couratier, P.; Guy, N.; et al. Early Diaphragm Pacing in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis

(RespiStimALS): A Randomised Controlled Triple-Blind Trial. Lancet Neurol. 2016, 15, 1217–1227. [CrossRef]

Erb, D.E.; Mora, R.J.; Bunge, R.P. Reinnervation of Adult Rat Gastrocnemius Muscle by Embryonic Motoneurons Transplanted

into the Axotomized Tibial Nerve. Exp. Neurol. 1993, 124, 372–376. [CrossRef] [PubMed]

Grumbles, R.M.; Wood, P.; Rudinsky, M.; Gomez, A.M.; Thomas, C.K. Muscle Reinnervation with Delayed or Immediate

Transplant of Embryonic Ventral Spinal Cord Cells into Adult Rat Peripheral Nerve. Cell Transplant. 2002, 11, 241–250. [CrossRef]

[PubMed]

Bryson, J.B.; Machado, C.B.; Crossley, M.; Stevenson, D.; Bros-Facer, V.; Burrone, J.; Greensmith, L.; Lieberam, I. Optical Control of

Muscle Function by Transplantation of Stem Cell-Derived Motor Neurons in Mice. Science 2014, 344, 94–97. [CrossRef]

Kurimoto, S.; Kato, S.; Nakano, T.; Yamamoto, M.; Takanobu, N.; Hirata, H. Transplantation of Embryonic Motor Neurons into

Peripheral Nerve Combined with Functional Electrical Stimulation Restores Functional Muscle Activity in the Rat Sciatic Nerve

Transection Model. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2016, 10, E477–E484. [CrossRef] [PubMed]

Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 8773

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.

13 of 14

Asano, K.; Nakano, T.; Tokutake, K.; Ishii, H.; Nishizuka, T.; Iwatsuki, K.; Onishi, T.; Kurimoto, S.; Yamamoto, M.; Tatebe, M.; et al.

Muscle Spindle Reinnervation Using Transplanted Embryonic Dorsal Root Ganglion Cells after Peripheral Nerve Transection in

Rats. Cell Prolif. 2019, 52, e12660. [CrossRef] [PubMed]

Asano, K.; Nakano, T.; Tokutake, K.; Ishii, H.; Nishizuka, T.; Iwatsuki, K.; Onishi, T.; Kurimoto, S.; Yamamoto, M.; Tatebe, M.; et al.

Innervation of Meissner’s Corpuscles And Merkel—Cells By Transplantation of Embryonic Dorsal Root Ganglion Cells after

Peripheral Nerve Section in Rats. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2021, 15, 586–595. [CrossRef]

Yohn, D.C.; Miles, G.B.; Rafuse, V.F.; Brownstone, R.M. Transplanted mouse embryonic stem-cell-derived motoneurons form

functional motor units and reduce muscle atrophy. J. Neurosci. 2008, 28, 12409–12418. [CrossRef]

Toma, J.S.; Shettar, B.C.; Chipman, P.H.; Pinto, D.M.; Borowska, J.P.; Ichida, J.K.; Fawcett, J.P.; Zhang, Y.; Eggan, K.; Rafuse, V.F.

Motoneurons derived from induced pluripotent stem cells develop mature phenotypes typical of endogenous spinal motoneurons.

J. Neurosci. 2015, 35, 1291–1306. [CrossRef]

Pepper, J.P.; Wang, T.V.; Hennes, V.; Sun, S.Y.; Ichida, J.K. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Motor Neuron

Transplant for Neuromuscular Atrophy in a Mouse Model of Sciatic Nerve Injury. JAMA Facial Plast. Surg. 2017, 19, 197–205.

[CrossRef]

Charitos, I.A.; Ballini, A.; Cantore, S.; Boccellino, M.; Di Domenico, M.; Borsani, E.; Nocini, R.; Di Cosola, M.; Santacroce, L.;

Bottalico, L. Stem Cells: A Historical Review about Biological, Religious, and Ethical Issues. Stem Cells Int. 2021, 2021, 9978837.

[CrossRef]

Guimaraes, M.Z.P.; De Vecchi, R.; Vitoria, G.; Sochacki, J.K.; Paulsen, B.S.; Lima, I.; Rodrigues da Silva, F.; da Costa, R.F.M.;

Castro, N.G.; Breton, L.; et al. Generation of iPSC-Derived Human Peripheral Sensory Neurons Releasing Substance P Elicited by

TRPV1 Agonists. Front. Mol. Neurosci. 2018, 11, 277. [CrossRef] [PubMed]

Yang, L.; Güell, M.; Niu, D.; George, H.; Lesha, E.; Grishin, D.; Aach, J.; Shrock, E.; Xu, W.; Poci, J.; et al. Genome-Wide Inactivation

of Porcine Endogenous Retroviruses (PERVs). Science 2015, 350, 1101–1104. [CrossRef] [PubMed]

Duggan, E.M.; Griesemer, A. Progress towards Xenogenic Tolerance. Curr. Opin. Organ Transplant. 2020, 25, 457–463. [CrossRef]

[PubMed]

Sauvageot, C.M.; Stiles, C.D. Molecular Mechanisms Controlling Cortical Gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 2002, 12, 244–249.

[CrossRef]

Qian, X.; Shen, Q.; Goderie, S.K.; He, W.; Capela, A.; Davis, A.A.; Temple, S. Timing of CNS Cell Generation: A Programmed

Sequence of Neuron and Glial Cell Production from Isolated Murine Cortical Stem Cells. Neuron 2000, 28, 69–80. [CrossRef]

Cooper, D.K.; Ezzelarab, M.B.; Hara, H.; Iwase, H.; Lee, W.; Wijkstrom, M.; Bottino, R. The Pathobiology of Pig-to-Primate

Xenotransplantation: A Historical Review. Xenotransplantation 2016, 23, 83–105. [CrossRef]

Patience, C.; Takeuchi, Y.; Weiss, R.A. Infection of Human Cells by an Endogenous Retrovirus of Pigs. Nat. Med. 1997, 3, 282–286.

[CrossRef]

Matsumoto, S.; Abalovich, A.; Wechsler, C.; Wynyard, S.; Elliott, R.B. Clinical Benefit of Islet Xenotransplantation for the Treatment

of Type 1 Diabetes. EBiomedicine 2016, 12, 255–262. [CrossRef]

Deacon, T.; Schumacher, J.; Dinsmore, J.; Thomas, C.; Palmer, P.; Kott, S.; Edge, A.; Penney, D.; Kassissieh, S.; Dempsey, P.; et al.

Histological Evidence of Fetal Pig Neural Cell Survival after Transplantation into a Patient with Parkinson’s Disease. Nat. Med.

1997, 3, 350–353. [CrossRef]

Aron Badin, R.; Vadori, M.; Vanhove, B.; Nerriere-Daguin, V.; Naveilhan, P.; Neveu, I.; Jan, C.; Lévèque, X.; Venturi, E.;

Mermillod, P.; et al. Cell Therapy for Parkinson’s Disease: A Translational Approach to Assess the Role of Local and Systemic

Immunosuppression. Am. J. Transplant. 2016, 16, 2016–2029. [CrossRef]

Björklund, A.; Stenevi, U.; Schmidt, R.H.; Dunnett, S.B.; Gage, F.H. Intracerebral Grafting of Neuronal Cell Suspensions. I.

Introduction and General Methods of Preparation. Acta Physiol. Scand. Suppl. 1983, 522, 1–7.

Barker, R.A.; Fricker, R.A.; Abrous, D.N.; Fawcett, J.; Dunnett, S.B. A Comparative Study of Preparation Techniques for Improving

the Viability of Nigral Grafts Using Vital Stains, In Vitro Cultures, and In Vivo Grafts. Cell Transplant. 1995, 4, 173–200. [CrossRef]

Barker, R.A.; Ratcliffe, E.; Richards, A.; Dunnett, S.B. Fetal Porcine Dopaminergic Cell Survival In Vitro and Its Relationship to

Embryonic Age. Cell Transplant. 1999, 8, 593–599. [CrossRef]

Grumbles, R.M.; Almeida, V.W.; Casella, G.T.; Wood, P.M.; Hemstapat, K.; Thomas, C.K. Motoneuron Replacement for Reinnervation of Skeletal Muscle in Adult Rats. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2012, 71, 921–930. [CrossRef] [PubMed]

Kato, S.; Kurimoto, S.; Nakano, T.; Yoneda, H.; Ishii, H.; Mita-Sugiura, S.; Hirata, H. Successful Transplantation of Motoneurons

into the Peripheral Nerve Depends on the Number of Transplanted Cells. Nagoya J. Med. Sci. 2015, 77, 253–263.

Sawada, H.; Kurimoto, S.; Tokutake, K.; Saeki, S.; Hirata, H. Optimal conditions for graft survival and reinnervation of denervated

muscles after embryonic motoneuron transplantation into peripheral nerves undergoing Wallerian degeneration. J. Tissue Eng.

Regen. Med. 2021, 15, 763–775. [CrossRef]

Deshpande, D.M.; Kim, Y.S.; Martinez, T.; Carmen, J.; Dike, S.; Shats, I.; Rubin, L.L.; Drummond, J.; Krishnan, C.; Hoke, A.; et al.

Recovery from Paralysis in Adult Rats Using Embryonic Stem Cells. Ann. Neurol. 2006, 60, 32–44. [CrossRef] [PubMed]

Grumbles, R.M.; Casella, G.T.; Rudinsky, M.J.; Godfrey, S.; Wood, P.M.; Thomas, C.K. The Immunophilin Ligand FK506, but

Not the P38 Kinase Inhibitor SB203580, Improves Function of Adult Rat Muscle Reinnervated from Transplants of Embryonic

Neurons. Neuroscience 2005, 130, 619–630. [CrossRef]

Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 8773

39.

40.

41.

14 of 14

Grumbles, R.M.; Sesodia, S.; Wood, P.M.; Thomas, C.K. Neurotrophic Factors Improve Motoneuron Survival and Function of

Muscle Reinnervated by Embryonic Neurons. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2009, 68, 736–746. [CrossRef] [PubMed]

Yu, P.; Matloub, H.S.; Sanger, J.R.; Narini, P. Gait Analysis in Rats with Peripheral Nerve Injury. Muscle Nerve 2001, 24, 231–239.

[CrossRef]

Rueden, C.T.; Schindelin, J.; Hiner, M.C.; DeZonia, B.E.; Walter, A.E.; Arena, E.T.; Eliceiri, K.W. ImageJ2: ImageJ for the next

generation of scientific image data. BMC Bioinform. 2017, 18, 529. [CrossRef] [PubMed]

...

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