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筋組織におけるジストロフィンの新たな生物学的意義に関する研究

庄子(寺本), 奈保美 東京大学 DOI:10.15083/0002004970

2022.06.22

概要

ジストロフィン(dp427)はX染色体上のジストロフィン遺伝子(DMD遺伝子)から翻訳される427kDaのタンパク質である。dp427は細胞膜直下に局在し、N末端では細胞骨格と結合し、C末端では複数の膜タンパク質と結合して細胞膜複合体(Dystrophin-glycoprotein complex: DGC)を形成する。このように細胞骨格と細胞膜を接続することにより、dp427は骨格筋・心筋の筋細胞膜を補強するという“メカニカルな機能”を果たす。DMD遺伝子に突然変異が生じると、変異の種類に伴ってdp427が完全に消失、または発現減少し、筋ジストロフィー症と呼ばれる持続的筋損傷を始めとする様々な病的状態が生じる。一方、近年の研究では、dp427はメカニカルな機能以外にも腫瘍細胞の増殖抑制作用などの“ノンメカニカルな機能”も併せもつ多機能分子であることが明らかになってきた。本研究ではDmd遺伝子に変異をもつ2種類の動物モデルを用い、第一章ではベッカー型筋ジストロフィー症において二次的に発現したジストロフィン断片が短縮型ジストロフィンの発現量減少に関与する可能性、第二章ではジストロフィンの欠損が横紋筋肉腫発生に関与する可能性を検討することで、DMD遺伝子変異がもたらす新たな影響をdp427の“メカニカル”および“ノンメカニカル”な機能の両側面から明らかにすることを目的とした。

第一章ジストロフィン遺伝子にin-frame変異をもつラットを用いた短縮型ジストロフィンの新規減少機構に関する検討
DMD遺伝子にin-frame変異が生じると、炎症性筋原性疾患であるベッカー型筋ジストロフィー症(Becker muscular dystrophy: BMD)が発症する。BMD患者の病態発生の主因は、患者筋組織で発現する短縮型ジストロフィン(truncateddp427:tdp427)の発現減少であり、発現量低下が著しいほど病態が悪化する。BMD患者筋生検の免疫染色では、このtdp427の発現減少を反映し、“patchy and faint”と形容されるジストロフィン染色強度の減弱が観察される。ところが、現在まで“patchy and faint”の病態を示す適切なモデル動物が存在せず、その詳しいメカニズムは不明であった。本章ではDmd遺伝子にエクソン3から16のin-frame変異をもつラット系統(IF系統)の作出を通じて、BMD患者筋組織におけるtdp427の減少メカニズムを明らかにすることを目的とした。

第一節ジストロフィン遺伝子にin-frame変異をもつラットのベッカー型筋ジストロフィー症モデル動物としての有用性の検証
BMD患者は筋組織病変とそれに伴う運動不耐性、心不全を示す。そこで本節では、IF系統がBMD患者にみられる典型的な病変を示すかを検証するため、筋組織の経時的な表現型解析および機能解析を行った。前脛骨筋切片におけるジストロフィン免疫染色の結果、IF系統では“patchy and faint”な染色パターンを示した。また、ウエスタンブロットの結果、IF系統骨格筋ではエクソン3から16の欠損に対応した分子量約350kDaのtdp427が発現していた。組織学的探索では、病態前期(2ヶ月齢)から後期(11ヶ月齢)にわたって壊死・炎症像の持続的な出現がみられ、筋再生は月齢に伴い低下した。この時、筋再生に関わる筋衛星細胞数は病態後期において野生型と比較して減少していた。このことから、IF系統における筋衛星細胞数の低下が月齢に伴う筋再生の低下に寄与したと推察された。

IF系統の骨格筋では筋ジストロフィー症の典型的所見である骨格筋内の線維組織・脂肪組織の蓄積や速筋における優先的な病態進行が観察された。骨格筋内の線維組織は病態前期に、脂肪組織は病態後期においてそれぞれ出現した。病態後期では、速筋において顕著な筋重量増加を示し、同時に筋線維径の有意な増加が見られた。これらの結果から、速筋でみられた筋重量の増加は間質組織の蓄積と筋線維の肥大の双方によるものと考えられた。

グリップテストにより10回連続測定した場合の最大筋力については、いずれの月齢でもIF系統と野生型間で違いはみられなかった。しかし、病態後期において、IF系統では測定を繰り返すことによる筋力低下が観察され、運動不耐性が生じていることが明らかとなった。一方、心筋においては線維組織の進行性の蓄積などの組織学的病変が観察されたものの、心エコーによる解析では機能的異常を示す所見は得られなかった。以上より、IF系統は、筋ジストロフィー症に特徴的な筋組織病変および運動不耐性を示す点において、BMD筋における病態進行機序の解明へと外挿可能なモデル動物であると考えられた。

第二節ジストロフィン遺伝子にin-frame変異をもつラットにおける短縮型ジストロフィンの発現動態解析
本節では、IF系統骨格筋におけるジストロフィンの発現動態解析を通じて、BMD筋において“patchy and faint”なジストロフィン発現が生じる機構を明らかにすることを目的とした。まず、IF系統の骨格筋組織に発現するtdp427の定量を行った結果、その発現量は野生型に発現するdp427と比較して有意に減少していた。そこで、Dmd遺伝子発現量を解析したところ、野生型と同等であった。次に、tdp427の減少が翻訳後のタンパク分解系の亢進によるものである可能性を考え、invitro筋管細胞におけるプロテアソーム阻害実験を行ったところ、tdp427に対するプロテアソーム分解はdp427と同等であった。以上より、tdp427の減少にはその他の機構が関与する可能性が示された。

Dmd遺伝子内には複数のプロモーター領域が存在し、C末端構造が共通の組織特異的アイソフォーム(dps)を発現する。野生型およびIF系統の骨格筋に発現するdpsをdp427のC末端を抗原とする抗体によって解析したところ、野生型の骨格筋では、dp427に加えて、Dmd遺伝子のエクソン72から79によってコードされ、全組織で恒常的に発現するとされる、71kDaのdp(dp71)が発現していた。一方で、IF系統ではtdp427とdp71に加えて分子量約75kDaの新規短縮型ジストロフィン(dpX)が発現していた。生化学的検討の結果、dpXはdp427と同様のC末端構造を持ち、筋細胞膜に局在してDGCを形成することが明らかになった。IF系統骨格筋におけるdpXの出現時期を調べたところ、胎齢20.5日にtdp427が発現を開始するのと一致してdpXの発現が観察された。また、dpXはtdp427が発現する骨格筋、心筋においてのみ発現がみられた。

dpXの本態についてさらなる解析を行った結果、リン酸化したdp71である可能性や、未知のDmd遺伝子産物に由来する新規dpsである可能性は低いことが示された。これらの結果と、dpXの発現がtdp427と同期していたことから、dpXはtdp427が何らかの酵素により切断された結果生じたタンパク質断片である可能性が考えられた。

dpsを過剰発現したマウス骨格筋では導入したdpsが細胞膜においてdp427と競合し優先的にDGCを形成した結果dp427の量が減少するという報告から、IF系統の骨格筋において発現するdpXも細胞膜においてtdp427と競合することでtdp427の発現量を減少させ、これが“patchy and faint”なジストロフィン発現に帰結していることが示唆された。

第二章がん抑制遺伝子p16及びジストロフィン遺伝子二重欠損に起因する横紋筋肉腫発症モデルラットの作出と腫瘍細胞の表現型解析
本章では筋系細胞由来腫瘍である横紋筋肉腫(Rhabdo myosarcoma: RMS)の発生におけるdp427の機能について検討した。RMSは小児がんのひとつとして臨床的に問題となるが、RMSを特異的に発症させる遺伝的変異は明らかではない。ヒトRMSではがん抑制遺伝子であるp16が高確率で欠損することが知られる。ところがp16遺伝子欠損マウスではRMSが発生しないため、p16遺伝子の欠損のみではRMSの発生に至らないと考えられる。近年、DMD遺伝子がRMSを含む筋系腫瘍において細胞増殖抑制作用をもつことが報告されたことから、dp427の有無がRMSの発症に関与している可能性が考えられる。そこで本章では、p16欠損ラット(p16-KO)、Dmd遺伝子のエクソン16にout-of-frame変異をもつdp427欠損ラット(Dmd-KO)、さらに両者の交配により作出した二重欠損ラット(dKO)を用い、これらにおけるRMS発症の有無について検討を行った。その結果、p16-KOおよびDmd-KOでは腫瘍発生は認められなかった一方、dKOでは9-11ヶ月齢の間に12/22個体(54.5%)において骨格筋内腫瘍が発生した。腫瘍における免疫組織化学的検索の結果、腫瘍細胞は筋系マーカー陽性であり、その形態から横紋筋肉腫(多形型)であると判定した。発生した腫瘍組織から分離した細胞の初代培養を行った結果、MyoDは陽性であったがmyogeninは陰性であったことから、dKOで発症したRMSを構成している腫瘍細胞は未分化な筋系細胞の特徴を有していると考えられた。以上の結果より、dp427の欠損は、未分化な筋系細胞に由来するRMS発症を引き起こすリスク因子であることが示された。

腫瘍細胞ではdp427だけではなくdp71も細胞増殖に関与する可能性が報告されている。そこで、dKOでみられたRMS由来の初代培養細胞におけるdpsの発現を解析したところ、いくつかの例でdp71の発現が著しく低下していた。1症例より分離した腫瘍細胞のクローン化を行ったところ、全てのクローンはMyoD陽性、myogenin陰性であったことから、いずれも未分化な筋系細胞に由来する腫瘍細胞という特徴を維持していることが確認された。一方で、得られた各クローンにおけるdp71の発現については高発現のものや低発現のものがみられた。これら得られたRMS由来の各クローン細胞は、今後、dp71の発現量の高低とRMSの悪性度との関連性について探るうえで有用なツールになるものと期待される。

本研究のまとめ
本研究では、ベッカー型筋ジストロフィー症でみられる短縮型ジストロフィンタンパク質の発現減少が、内因性に発生した短縮型ジストロフィン切断産物によって生じる可能性を新たに示した。また、ジストロフィンタンパク質は横紋筋肉腫の発生を抑制する機能をもつことを示した。本研究はジストロフィンのメカニカル、ノンメカニカルな機能に関する新しい知見を与えDMD遺伝子変異に起因する疾患の包括的な理解に寄与すると考えられる。

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