リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

大学・研究所にある論文を検索できる 「タンパク質のサイトゾル送達を可能とする脂質ナノ粒子の調製」の論文概要。リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。
リケラボ

コピーが完了しました

URLをコピーしました

論文の公開元へ論文の公開元へ
書き出し

タンパク質のサイトゾル送達を可能とする脂質ナノ粒子の調製

平井, 勇祐 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k24561

2023.03.23

概要

タンパク質のサイトゾル送達を可能とする
脂質ナノ粒子の調製

2022

平井

勇祐

目次
序論

3

第一章 負電荷タンパク質をサイトゾルに送達可能な脂質ナノ粒子の調製

5

第一節 NLS-(−30)GFP を内封する LNP の調製

6

第二節 LNP による NLS-(−30)GFP の細胞内送達能の評価

12

第三節 時間および濃度依存的な LNP による NLS-(−30)GFP のサイトゾル送達

18

第四節 NLS-(−30)GFP-LNP の細胞内取り込み機構の解明

20

第五節 LNP のサイトゾルへのカーゴ送達におけるエンドソーム成熟の必要性

22

第一章の考察

23

第二章 細胞内タンパク質の標的化を目的とした抗体内封脂質ナノ粒子の調製

26

第一節 抗体内封脂質ナノ粒子の調製

27

第二節 LNP による IgG の細胞内送達能の評価

31

第三節 抗体内封脂質ナノ粒子の抗体送達メカニズム解析

35

第四節 抗体内封脂質ナノ粒子調製におけるポリグルタミン酸の重要性

37

第五節 LNP に封入された抗体がサイトゾルに送達されていることの確認

41

第六節 LNP による細胞内タンパク質を認識する抗体の送達

43

第七節 機能性抗体導入による細胞機能の制御

47

第二章の考察

49

総括

51

実験の部

53

引用文献

67

謝辞

70

1

略号一覧
α-MEM

α-minimum essential medium

BS

bovine serum

CLSM

confocal laser scanning microscopy

CPZ

chlorpromazine

DDS

drug delivery system

DIC

differential interference contrast

DLS

dynamic light scattering

EIPA

5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride

EGFP

enhanced green fluorescent protein

(−30)GFP

super-negatively charged green fluorescent protein

hIgG-AF488

Alexa Fluor 488-labeled human immunoglobulin G

hIgG-AF594

Alexa Fluor 594-labeled human immunoglobulin G

IgG

immunoglobulin G

LNP

lipid nanoparticle

NLS

nuclear localization signal

MWCO

molecular wight cut off

NPC

nuclear pore complex

PBS(−)

phosphate buffered saline without containing Ca2+ and Mg2+

polyE

poly-L-glutamic acid

PdI

polydispersity index

SDS-PAGE

sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

TEM

transmission electron microscopy

2

序論

抗体をはじめとするタンパク質は、その生体における多彩な効果から、種々の疾患に対しての貴
重な医薬品シーズとなりうる(1)。しかしながら、タンパク質は親水性の高分子であり、単独で細胞膜
を透過することができない。このため、タンパク質医薬の機能発現の場は細胞外に限局されている。
タンパク質を細胞内に送達可能な Drug Delivery System（DDS）の確立は、タンパク質医薬品の適
用範囲を細胞外から細胞内に拡大でき、新薬創出を加速すると期待される(2, 3)。
細胞内分子を標的とするタンパク質以外に、細胞内特にサイトゾルに送達されなければ機能を発
揮できない高分子として、核酸（プラスミド DNA、RNA 干渉を誘導する small interfering RNA
（siRNA）やメッセンジャーRNA（mRNA）など）が挙げられる(4)。近年、siRNA 送達による RNA
干渉治療薬として、トランスサイレチン型家族性アミロイドポリニューロパチーの治療薬である
ONPATTROTM、SARS-CoV-2 に対する mRNA ワクチン製剤である ComirnatyTM、SpikevaxTM が臨
床応用され、バイオ医薬品の適用範囲が拡大している(5, 6)。これら核酸のサイトゾル送達を可能とす
る DDS 技術として用いられているのが、lipid nanoparticle（LNP）技術である。LNP は核酸医薬を
高効率に内封化し、血中での核酸の分解を保護することで半減期を向上させ、また高いエンドソー
ム脱出能を有する機能性脂質（pH 応答性脂質）を搭載することで核酸分子のサイトゾルへの送達を
増強する脂質ナノ粒子製剤である(5–7)。LNP 技術の台頭により、医薬ニーズを解消する核酸医薬品の
開発が精力的に行われており、医薬業界に革命的な影響を与えると予想される。一方で、LNP 技術
は、何も核酸医薬に限定される必要は無い。つまり、他のバイオ医薬品の DDS 技術としても LNP
技術が応用できれば、より一層のブレイクスルーとなると考えられる。そこで、本研究では、細胞内
分子を標的化するタンパク質をサイトゾルに送達可能な脂質ナノ粒子製剤の開発を行った。
第一章では、LNP 技術がタンパク質の細胞内送達に応用できるかどうかを確認するために、表面
電荷を負にアレンジした組み換え緑色蛍光タンパク質である(−30)GFP をモデルタンパク質として
選択し、これを内封する LNP を調製した(8, 9)。調製した LNP を細胞に添加し、共焦点レーザー顕微
鏡による(−30)GFP の局在を観察することでサイトゾルへの送達能を評価した。

3

第二章では、細胞内分子を標的化する抗体（Immunoglobulin G, IgG）を内封する LNP を調製し
た。IgG の等電点は塩基性側であるため、LNP 調製を行う際の低 pH 溶液中で負に帯電しておらず、
内封化が困難であると予想された(10)。そこで、タンパク質と高分子電解質を混合することで、液-液
相分離による高濃度にタンパク質を含有する液滴形成技術に着目した(11)。抗体の場合、酸性アミノ
酸ポリマーであるポリグルタミン酸（polyE）と抗体を低 pH 溶液中で混合することにより、負電荷
を帯びた高濃度抗体液滴が形成される(12)。この負電荷液滴を脂質でパッケージングすることにより、
IgG を内封する脂質ナノ粒子を調製した。調製した抗体内封脂質ナノ粒子を細胞に添加し、共焦点
レーザー顕微鏡による抗体分子の局在を観察することで、細胞内に送達された抗体が、細胞内標的
分子を認識できるかどうか検討した。

4

第一章
負電荷タンパク質をサイトゾルに送達可能な脂質ナノ粒子の調製

タンパク質の細胞内導入技術の確立は、タンパク質医薬品の適用範囲を拡大できるため、盛んに
研究が行われ、臨床への応用が待望されている(3)。そこで本章では、核酸医薬の細胞内導入技術とし
て用いられている lipid nanoparticle（LNP）技術を、タンパク質の細胞内導入技術として応用でき
るかどうか検討を行った。
筆者は以前、pH 応答性脂質の一種である charge-reversible 脂質を使った small interfering RNA
（siRNA）をがん細胞内へ導入可能な LNP 調製を行い、RNA 干渉誘導による標的遺伝子の発現を
低下させることに成功している(13)。pH 応答性脂質は核酸溶液である酸性緩衝液と混合されること
で正電荷を帯び、負電荷高分子である核酸と静電的相互作用を介し、脂質粒子内に核酸を内包する
役割を担う(7)。つまり、LNP 技術をタンパク質送達に応用するためには、タンパク質の表面電荷を
負に調整する必要がある。そこで、細胞内へのタンパク質の送達効率を confocal laser scanning
microscopy（CLSM）にて評価するため、モデルタンパク質としてネットチャージが−30 になるよ
うに遺伝子組み換えされた緑色蛍光タンパク質（(−30)GFP）を選択した(8)。また、サイトゾルに
(−30)GFP が送達されたことを評価しやすくするため、核移行配列（NLS）を付加した NLS(−30)GFP を設計し、これをモデルタンパク質とした(14, 15)。
第一章では、charge-reversible 脂質を含む脂質組成で NLS-(−30)GFP を封入する LNP（NLS(−30)GFP-LNP）を調製し、ヒト子宮頸がん（HeLa）細胞のサイトゾルにまで NLS-(−30)GFP を送
達できることを CLSM 観察により明らかとした。LNP による NLS-(−30)GFP の送達効率は、LNP
添加後のインキュベート時間および濃度依存的であることが確認された。さらに、エンドサイトー
シス阻害剤を用いた検討により、NLS-(−30)GFP-LNP はクラスリン介在性エンドサイトーシスおよ
びマクロピノサイトーシスにより細胞内移行することが示唆された。また、エンドソーム酸性化阻
害剤を用いた実験により、NLS-(−30)GFP-LNP によるサイトゾルへの NLS-(−30)GFP の送達には、
エンドソームの成熟に伴うエンドソーム管腔内の pH の低下（酸性化）が重要であることが示され
た。

5

第一節 NLS-(−30)GFP を内封する LNP の調製
pH 応答性脂質の一種である charge-reversible 脂質（dioleoylglycerophosphate-diethylenediamine
（DOP-DEDA）
）を主要構成脂質とする LNP は、先行研究において siRNA のがん細胞内への効率
的な送達を可能とすることが明らかとされた(13)。siRNA などの核酸分子の代わりに、負電荷モデル
タンパク質である NLS-(−30)GFP（protein net charge = −25）を LNP 内に封入することにより、タ
ンパク質のサイトゾルへの送達が可能になるのではないかと考えた（Figure 1）
。
NLS-(−30)GFP を内封する LNP（NLS-(−30)GFP-LNP）を調製する際に用いる脂質を Figure 2
にまとめた。核酸を送達可能な LNP の調製において最も重要な脂質は、pH 応答性脂質である。pH
応答性脂質は、一般的に酸性 pH 条件下で正電荷を帯び、一方で中性 pH 条件下では荷電しないよう
に設計されている(16)。つまり、LNP の調製を行う低 pH 条件下において、pH 応答性脂質は正電荷
を帯びており、内封したい負電荷分子と静電的相互作用を生み出し、LNP 内への封入・保持を高め
ることができる。また、LNP が細胞内にエンドサイトーシスにより取り込まれた後、pH 応答性脂
質はエンドソーム成熟に伴う管腔内の pH 低下に伴い正に帯電し、エンドソーム内の酸性脂質との
相互作用を高め、エンドソーム膜の破壊または脂質膜融合を誘発し、内封した負電荷分子のサイト
ゾルへの送達を可能とする(17, 18)。さらに、細胞培養条件や血中における中性 pH 条件下において、
pH 応答性脂質は正電荷を帯びていないため、非特異的な細胞との相互作用による細胞傷害や非特異
的な血清タンパク質の吸着を回避しやすく臨床での有用性が高い(19)。一方で、charge-reversible 脂
質は他の pH 応答性脂質と同様に、pH 変化に伴い親水基の電荷状態を変えることができるが、両ア
ミンの pKa は約 6、10 であるため生理的 pH 条件下においても電荷を失わない（実効電荷反転型）
特徴を有するユニークな脂質である（Figure 2 上段）(13)。また、ヘルパー脂質として合成リン脂質
である dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholine（DPPC）
、ナノ粒子の安定性および膜融合活性
を高める役割を担う cholesterol、ナノ粒子同士の凝集性を抑制するために polyethylene glycol（PEG）
化脂質を構造脂質として選択した(20–22)。

6

Figure 1. A strategy of cytosolic delivery of NLS-(−30)GFP using charge-reversible lipid-based carrier

Figure 2. Structure of lipids for preparation of NLS-(−30)GFP-LNP. Dioleoylglycerophosphatediethylenediamine (DOP-DEDA) as a pH-sensitive, charge-reversible lipid; Dipalmitoyl-sn-glycerol-3phosphatidylcholine

(DPPC);

Cholesterol;

1,2-dimylystoyl-rac-glycerol-3-methylpolyoxyethylene-

polyethyleneglycol chain, molecular weight 5000 (DMG-PEG5k).
7

LNP 調製時の脂質組成は、siRNA 送達において活性の高かった脂質組成を参考に、DOPDEDA/DPPC/Cholesterol = 45/10/45（モル比）とした(13)。また、DMG-PEG5k は、脂質全体量に
対して 1 mol%となるように加えた。これら脂質を tert-butyl alcohol（t-BuOH）に溶解し、脂質溶
液とした。また、LNP に内封したい NLS-(−30)GFP は、1 mM クエン酸緩衝液に溶解しタンパク質
溶液とした。これら溶液を 40℃で 30 分加温後、任意の混合比でピペッティング操作により混合し、
その後、余分な有機溶媒を除去するため超純水にて透析処理を行い、NLS-(−30)GFP-LNP を調製し
た（Figure 3）
。

Figure 3. Scheme of NLS-(−30)GFP-LNP preparation. The lipids (at a molar ratio of DOPDEDA/DPPC/Cholesterol = 45/10/45 + 1 mol% DMG-PEG5k) dissolved in tert-butyl alcohol (t-BuOH) and
NLS-(−30)GFP dissolved in 1 mM citrate buffer were heated at 40 °C for 30 min. Then, the solutions were mildly
mixed by pipetting for 30 times. The mixture was then dialyzed against ultrapure water (MilliQ) to remove the
t-BuOH.
8

まず始めに、NLS-(−30)GFP を溶解しておく 1 mM クエン酸緩衝液の pH によって生じる LNP
の物性の差について検討した。1 mM クエン酸緩衝液の pH を 4.5、5.0、5.5、6.0 に調整し、NLS(−30)GFP-LNP を調製後、粒子径および polydispersity index（PdI）を Zetasizer Nano S により測
定した（Table 1）
。ただし、NLS-(−30)GFP と脂質の混合質量比は、NLS-(−30)GFP : lipids = 1 : 10
(w/w)、脂質溶液と NLS-(−30)GFP 溶液の混合体積比は NLS-(−30)GFP : lipids = 5 : 1 に固定して
LNP 調製を行った。その結果、pH 4.5 の NLS-(−30)GFP 溶液では、他の条件と比較して粒子径お
よび PdI が大きくなった。粒子径および PdI が一番小さく、DOP-DEDA が十分に正電荷に荷電し、
NLS-(−30)GFP を高効率に内封化が期待される 1 mM クエン酸溶液 pH 5.0 をタンパク質溶液とし
て用いることとした。
Table 1. Effect of pH of the citrate buffer on NLS-(−30)GFP-LNP formulation.
Mass ratio

1 mM citrate buffer pH

Size（d.nm）

PdI

4.5

243 ± 42

0.272 ± 0.07

5.0

172 ± 12

0.156 ± 0.04

5.5

181 ± 12

0.198 ± 0.05

6.0

180 ± 36

0.201 ± 0.1

1 : 10

Lipids were composed of DOP-DEDA, DPPC and cholesterol at 45 : 10 : 45 molar ratio and 1 mol% DMG-PEG5k
was added. Results are represented as the mean ± standard deviation (SD) of more than three independent experiments.
Lipid concentration of 25 mM and protein/lipid mass ratio of 1 : 10 were employed. Results are presented as the
mean ± standard deviation (SD) of more than three independent experiments.

次に、NLS-(−30)GFP 溶液と脂質溶液の混合体積比によって生じる LNP の物性の差について検
討した。脂質溶液に対する NLS-(−30)GFP 溶液の体積比が、3、5、7、10 倍となるように LNP を
調製後、粒子径および PdI を測定した（Table 2）
。ただし、NLS-(−30)GFP と脂質の混合質量比は、
NLS-(−30)GFP : lipids = 1 : 10 (w/w)に固定し LNP 調製を行った。その結果、体積比が NLS(−30)GFP 溶液/脂質溶液 = 5 : 1 以上で均一なナノ粒子が調製できることが分かった。最終 LNP 溶
液量が少ない方が、細胞実験等の検討に都合が良いため、LNP 調製時の混合体積比は、NLS(−30)GFP 溶液/脂質溶液 = 5 : 1 に決定した。
9

Table 2. Effect of volume ratios of aqueous/organic phases on NLS-(−30)GFP-LNP formulation.
Mass ratio

NLS-(−30)GFP/lipid [v/v]

Size（d.nm）

PdI

3:1

1081 ± 479

0.308 ± 0.05

5:1

172 ± 12

0.156 ± 0.04

7:1

176 ± 47

0.202 ± 0.06

10 : 1

135 ± 5

0.183 ± 0.04

1 : 10

Lipids were composed of DOP-DEDA, DPPC and cholesterol at 45 : 10 : 45 molar ratio and 1 mol% DMG-PEG5k
was added. Results are represented as the mean ± SD of more than three independent experiments. Lipid
concentration of 25 mM and protein/lipid mass ratio of 1 : 10 were employed.

さらに、NLS-(−30)GFP と脂質の混合質量比に着目し、脂質濃度を 25 mM に固定し、NLS(−30)GFP : lipids = 1 : 10 – 50 の範囲で NLS-(−30)GFP-LNP を調製し、粒子径および PdI を測定
した（Table 3）
。その結果、NLS-(−30)GFP に対する脂質の量が多い、つまり NLS-(−30)GFP の濃
度が低い方が、粒子直径の小さい均一なナノ粒子を調製できることが明らかとなった。
Table 3. Physicochemical characterization of NLS-(−30)GFP-LNP by mixing NLS-(−30)GFP with lipids at various
mass ratios.
Mass ratio

NLS-(−30)GFP (μM)

1 : 10

lipid (mM)

Size（d.nm）

PdI

10.3

172 ± 12

0.156 ± 0.04

1 : 20

5.2

154 ± 32

0.134 ± 0.09

1 : 30

3.4

116 ± 20

0.164 ± 0.08

1 : 40

2.6

98 ± 8

0.154 ± 0.05

1 : 50

2.1

92 ± 11

0.126 ± 0.01

25

The lipid mixture was composed of DOP-DEDA, DPPC, and cholesterol at a 45 : 10 : 45 molar ratio, and 1 mol%
DMG-PEG5k was added. The mass ratios denote NLS-(−30)GFP-LNP/total lipids (w/w). Results are presented as
the mean ± standard deviation (SD) of more than three independent experiments.

10

最後に、NLS-(−30)GFP-LNP の粒子形態観察を Cryo-TEM によって解析した。NLS-(−30)GFP
と脂質の混合質量比により、LNP の粒子径に変化があったため、差の大きかった質量比 1 : 10 およ
び 1 : 50 の NLS-(−30)GFP-LNP（各々NLS-(−30)GFP-LNP(1 : 10)、NLS-(−30)GFP-LNP(1 : 50)
と示す）の観察を行った（Figure 4 (A), (B)）
。dynamic light scattering（DLS）の結果に相関し、NLS(−30)GFP-LNP(1 : 50)の方が粒子径のより小さな粒子が確認された。 ...

論文の公開元へ

この論文で使われている画像

関連論文

関連論文をもっと見る

参考文献

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

B. Leader, Q. J. Baca, D. E. Golan, Protein therapeutics: A summary and pharmacological

classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21–39 (2008).

S. Mitragotri, P. A. Burke, R. Langer, Overcoming the challenges in administering

biopharmaceuticals: Formulation and delivery strategies. Nat. Rev. Drug Discov. 13, 655–672

(2014).

R. Goswami, T. Jeon, H. Nagaraj, S. Zhai, V. M. Rotello, Accessing Intracellular Targets

through Nanocarrier-Mediated Cytosolic Protein Delivery. Trends Pharmacol. Sci. 41, 743–

754 (2020).

J. A. Kulkarni, et al., The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat. Nanotechnol. 16,

630–643 (2021).

A. Akinc, et al., The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing

nucleic acid-based drugs. Nat. Nanotechnol. 14, 1084–1087 (2019).

Y. Suzuki, H. Ishihara, Difference in the lipid nanoparticle technology employed in three

approved siRNA (Patisiran) and mRNA (COVID-19 vaccine) drugs. Drug Metab.

Pharmacokinet. 41 (2021).

P. R. Cullis, M. J. Hope, Lipid Nanoparticle Systems for Enabling Gene Therapies. Mol. Ther.

25, 1467–1475 (2017).

M. S. Lawrence, K. J. Phillips, D. R. Liu, Supercharging proteins can impart unusual

resilience. J. Am. Chem. Soc. 129, 10110–10112 (2007).

Y. Hirai, H. Hirose, M. Imanishi, T. Asai, S. Futaki, Cytosolic protein delivery using pHresponsive, charge-reversible lipid nanoparticles. Sci. Rep. 11, 1–13 (2021).

栗之丸隆章, 白木賢太郎, タンパク質沈殿-再溶解法による高濃度タンパク質医薬品の調製.

化学と生物 53, 368–373 (2015).

A. B. Kayitmazer, D. Seeman, B. B. Minsky, P. L. Dubin, Y. Xu, Protein-polyelectrolyte

interactions. Soft Matter 9, 2553–2583 (2013).

M. Mimura, K. Tsumura, A. Matsuda, N. Akatsuka, K. Shiraki, Effect of additives on liquid

droplet of protein-polyelectrolyte complex for high-concentration formulations. J. Chem.

Phys. 150 (2019).

Y. Hirai, et al., Charge-reversible lipid derivative: A novel type of pH-responsive lipid for

nanoparticle-mediated siRNA delivery. Int. J. Pharm. 585, 119479 (2020).

D. Kalderon, B. L. Roberts, W. D. Richardson, A. E. Smith, A short amino acid sequence able

to specify nuclear location. Cell 39, 499–509 (1984).

M. Ray, R. Tang, Z. Jiang, V. M. Rotello, Quantitative Tracking of Protein Trafficking to the

Nucleus Using Cytosolic Protein Delivery by Nanoparticle-Stabilized Nanocapsules.

Bioconjug. Chem. 26, 1004–1007 (2015).

X. Han, et al., An ionizable lipid toolbox for RNA delivery. Nat. Commun. 12, 8–13 (2021).

M. Jayaraman, et al., Maximizing the Potency of siRNA Lipid Nanoparticles for Hepatic Gene

Silencing In Vivo**. Angew. Chemie 124, 8657–8661 (2012).

M. Schlich, et al., Cytosolic delivery of nucleic acids: The case of ionizable lipid nanoparticles.

Bioeng. Transl. Med. 6, 1–16 (2021).

X. Hou, T. Zaks, R. Langer, Y. Dong, Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat. Rev. Mater.

6, 1078–1094 (2021).

X. Cheng, R. J. Lee, The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for

oligonucleotide delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 99, 129–137 (2016).

N. M. Belliveau, et al., Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for

in vivo delivery of siRNA. Mol. Ther. - Nucleic Acids 1, e37 (2012).

J. A. Kulkarni, D. Witzigmann, J. Leung, Y. Y. C. Tam, P. R. Cullis, On the role of helper

lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale 11, 21733–21739 (2019).

J. A. Kulkarni, et al., On the Formation and Morphology of Lipid Nanoparticles Containing

Ionizable Cationic Lipids and siRNA. ACS Nano 12, 4787–4795 (2018).

67

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41. ,

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

J. Gilleron, et al., Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery,

intracellular trafficking and endosomal escape. Nat. Biotechnol. 31, 638–646 (2013).

B. P. Cormack, R. H. Valdivia, S. Falkow, FACS-optimized mutants of the green fluorescent

protein (GFP). Gene 173, 33–38 (1996).

Y. Y. C. Tam, S. Chen, P. R. Cullis, Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.

Pharmaceutics 5, 498–507 (2013).

D. C. Litzinger, L. Huang, Phosphatodylethanolamine liposomes: drug delivery, gene transfer

and immunodiagnostic applications. BBA - Rev. Biomembr. 1113, 201–227 (1992).

K. J. Kauffman, et al., Optimization of Lipid Nanoparticle Formulations for mRNA Delivery in

Vivo with Fractional Factorial and Definitive Screening Designs. Nano Lett. 15, 7300–7306

(2015).

S. Behzadi, et al., Cellular uptake of nanoparticles: Journey inside the cell. Chem. Soc. Rev. 46,

4218–4244 (2017).

I. Nakase, et al., Cellular uptake of arginine-rich peptides: Roles for macropinocytosis and

actin rearrangement. Mol. Ther. 10, 1011–1022 (2004).

L. Von Kleist, et al., Role of the clathrin terminal domain in regulating coated pit dynamics

revealed by small molecule inhibition. Cell 146, 471–484 (2011).

O. Meier, et al., Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with

its clathrin-mediated uptake. J. Cell Biol. 158, 1119–1131 (2002).

N. Araki, M. T. Johnson, J. A. Swanson, A role for phosphoinositide 3-kinase in the

completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. J. Cell Biol. 135, 1249–

1260 (1996).

B. Poole, S. Ohkuma, Effect of weak bases on the intralysosomal pH in mouse peritoneal

macrophages. J. Cell Biol. 90, 665–669 (1981).

T. Wei, Q. Cheng, Y. L. Min, E. N. Olson, D. J. Siegwart, Systemic nanoparticle delivery of

CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins for effective tissue specific genome editing. Nat. Commun.

11, 1–12 (2020).

Y. Suzuki, et al., Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein–oligonucleotide complexes

synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editing and hepatitis B virus

inhibition. J. Control. Release 330, 61–71 (2021).

M. Danaei, et al., Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of

lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics 10, 1–17 (2018).

M. A. Hink, et al., Structural dynamics of green fluorescent protein alone and fused with a

single chain Fv protein. J. Biol. Chem. 275, 17556–17560 (2000).

S. Jin, et al., Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal

Transduct. Target. Ther. 7 (2022).

P. J. Carter, A. Rajpal, Designing antibodies as therapeutics. Cell 185, 2789–2805 (2022).

JP2018065765A_抗体ポリグルタミン酸製剤の特許.pdf.

H. Tanaka, et al., Self-Degradable Lipid-Like Materials Based on “Hydrolysis accelerated by

the intra-Particle Enrichment of Reactant (HyPER)” for Messenger RNA Delivery. Adv.

Funct. Mater. 30 (2020).

M. Herrera, J. Kim, Y. Eygeris, A. Jozic, G. Sahay, Illuminating endosomal escape of

polymorphic lipid nanoparticles that boost mRNA delivery. Biomater. Sci. 9, 4289–4300

(2021).

J. Rejman, A. Bragonzi, M. Conese, Role of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis in

gene transfer mediated by lipo- and polyplexes. Mol. Ther. 12, 468–474 (2005).

T. Moriyama, J. P. Marquez, T. Wakatsuki, A. Sorokin, Caveolar Endocytosis Is Critical for BK

Virus Infection of Human Renal Proximal Tubular Epithelial Cells. J. Virol. 81, 8552–8562

(2007).

K. Sakamoto, et al., Optimizing Charge Switching in Membrane Lytic Peptides for Endosomal

Release of Biomacromolecules. Angew. Chemie - Int. Ed. 59, 19990–19998 (2020).

M. J. Munson, et al., A high-throughput Galectin-9 imaging assay for quantifying nanoparticle

uptake, endosomal escape and functional RNA delivery. Commun. Biol. 4 (2021).

A. S. Dixon, et al., NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate

Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chem. Biol. 11, 400–408 (2016).

68

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

57.

58.

59.

60.

61.

62.

63.

S. L. Y. Teo, et al., Unravelling cytosolic delivery of cell penetrating peptides with a

quantitative endosomal escape assay. Nat. Commun. 12 (2021).

S. Okano, et al., Split luciferase-based estimation of cytosolic cargo concentration delivered

intracellularly via attenuated cationic amphiphilic lytic peptides. Bioorganic Med. Chem. Lett.

72, 128875 (2022).

N. P. Andrews, et al., A toolbox of igg subclass-switched recombinant monoclonal antibodies

for enhanced multiplex immunolabeling of brain. Elife 8, 1–27 (2019).

J. S. Goodwin, K. R. Drake, C. L. Remmert, A. K. Kenworthy, Ras diffusion is sensitive to

plasma membrane viscosity. Biophys. J. 89, 1398–1410 (2005).

T. F. Franke, C. P. Hornik, L. Segev, G. A. Shostak, C. Sugimoto, PI3K/Akt and apoptosis:

Size matters. Oncogene 22, 8983–8998 (2003).

K. Dutta, P. Kanjilal, R. Das, S. Thayumanavan, Synergistic Interplay of Covalent and Non‐

Covalent Interactions in Reactive Polymer Nanoassembly Facilitates Intracellular Delivery of

Antibodies. Angew. Chemie 133, 1849–1858 (2021).

M. Brentnall, L. Rodriguez-Menocal, R. L. De Guevara, E. Cepero, L. H. Boise, Caspase-9,

caspase-3 and caspase-7 have distinct roles during intrinsic apoptosis. BMC Cell Biol. 14

(2013).

H. H. Wang, A. Tsourkas, Cytosolic delivery of inhibitory antibodies with cationic lipids. Proc.

Natl. Acad. Sci. U. S. A. 116, 22132–22139 (2019).

R. Mout, et al., General Strategy for Direct Cytosolic Protein Delivery via ProteinNanoparticle Co-engineering. ACS Nano 11, 6416–6421 (2017).

A. K. K. Leung, Y. Y. C. Tam, S. Chen, I. M. Hafez, P. R. Cullis, Microfluidic Mixing: A

General Method for Encapsulating Macromolecules in Lipid Nanoparticle Systems. J. Phys.

Chem. B 119, 8698–8706 (2015).

B. Vogelstein, et al., Cancer Genome Landscapes_Review_TOP. Science (80-. ). 339, 1546–

1558 (2013).

J. Lv, Q. Fan, H. Wang, Y. Cheng, Polymers for cytosolic protein delivery. Biomaterials 218,

119358 (2019).

Y. Li, Z. Ye, H. Yang, Q. Xu, Tailoring combinatorial lipid nanoparticles for intracellular

delivery of nucleic acids, proteins, and drugs. Acta Pharm. Sin. B 12, 2624–2639 (2022).

D. Clift, et al., A Method for the Acute and Rapid Degradation of Endogenous Proteins. Cell

171, 1692-1706.e18 (2017).

S. Du, et al., Cell-Permeant Bioadaptors for Cytosolic Delivery of Native Antibodies: A “mixand-Go” Approach. ACS Cent. Sci. 6, 2362–2376 (2020).

69

謝辞

終わりに臨み、終始ご懇篤なるご指導ならびにご鞭撻を賜りました京都大学化学研究所

史朗

教授に謹んで感謝の意を表します。

数々のご指導、ご助言をいただきました浅井 知浩 博士（静岡県立大学

士（京都大学化学研究所

祥正

二木

准教授）

、広瀬

博士（京都大学化学研究所

久昭

助教）、河野

教授）

、今西 未来 博

博士（京都大学化学研究所

健一

特定准教授）、川口

博士（京都大学大学院薬学研究科

助教）

に深く感謝いたします。

本研究において使用した charge-reversible 脂質をご提供いただいた日本精化株式会社に深く御礼

申し上げます。第一章における電子顕微鏡観察は、文部科学省委託事業ナノテクノロジープラット

フォーム課題として京都大学微細構造解析プラットフォームの支援（課題番号 JPMX09A20KT0015）

を受けて実施されました。関係者の皆様に感謝いたします。

研究のみならず研究室であらゆる面で支えて下さった京都大学化学研究所

生体機能設計化学研

究領域の皆様に心より陳謝いたします。

本研究の遂行にあたっては日本薬学会長井記念薬学研究奨励金の助成によるものであり、感謝し

たします。また、本研究の一部は日本学術振興会 DC1 の援助によるものであり、感謝いたします。

最後に、私の研究活動を温かく見守り支えて下さった家族に、この場を借りて深く感謝申し上げ

ます。

70

...

参考文献をもっと見る

全国の大学の
卒論・修論・学位論文
を
一発検索！

この論文の関連論文を見る