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γ-Glutamylcysteineの効率的な生産系の開発とglutathione代謝酵素に対する反応性の解析

村岡, 未彩 大阪大学 DOI:10.18910/89571

2022.09.22

概要

γ-グルタミルシステイン（γ-EC）はglutamate-cysteine ligase（GCL）がATP依存的に、L-グルタミン酸（Glu）をγ位でL-システイン（Cys）に結合させることで生成されるジペプチドである。この反応はグルタチオン（GSH）生合成の２段階の反応のうちの第１段階であり、第２段階では、glutathione synthetase（GS）により、 γ-ECとグリシン（Gly）からGSHが生成される。GSH生合成系の律速はこの第１段階の反応にあり、GCLの活性は細胞内のGSH濃度によって巧妙に調節されており、GSHのホメオスタシス維持を担っている。一方、第２段階の反応を触媒するGSは常時高い活性を維持しており、第１反応で合成されたγ-ECは直ちにGSHへ変換される。このため、通常の生理条件では細胞中のγ-EC濃度は極めて低い状態にある。γ-ECは、GSHと同様にGluがγ位でCysと結合した構造を持つことから、GSHと同等の抗酸化機能を有すること、さらに細胞内に取り込まれればGSHの供給源となることが期待され、実際にγ-ECの機能に関する研究が行われるようになってきた。しかし、その生理機能の詳細に関してはほとんど明らかになっていない。

GSHは生体内で重要な機能を担うことから、その代謝調節や細胞内のGSHの機能を直接強化するための研究が数多く行われてきた。しかしこれまでの研究結果から、外部からのGSHの投与によって細胞内のGSH濃度は大きく変化しないことが示されている。これは、一部の細胞種を除いてGSHを細胞内に取り込むトランスポーターが存在せず、また細胞内のGSH濃度は一般的に1～10 mMと高濃度であるのに対し、細胞外では2～10 μMであり大きな濃度勾配があるため、GSHが細胞外から細胞内に積極的に取り込まれ難いことが理由として挙げられる。そこで、細胞内のGSH濃度を増加させるための手段として、細胞内に取り込まれCysに変換されるN-acetyl cysteine(NAC)を投与し、GSH生合成の基質となるCysの濃度を上昇させる研究が行われた。一方で、老化や加齢に伴って罹患率が上昇する慢性疾患等においては、細胞内のGSHの濃度が常時低い状態にあることが知られている。近年このようなGSH濃度の低下は、GCLの発現異常や活性低下に起因することを示唆する研究が報告されるようになった。通常健全な細胞では、 GSHが細胞内で抗酸化機能を発揮することによって濃度が低下した場合、GCLの発現が促進されて迅速にGSHが供給されるが、老化した細胞や慢性疾患の細胞においてはこのGCL発現系が異常をきたし、GSHが十分に補給できず、ホメオスタシスの維持が困難となることが示唆されている。この場合、NACを投与して細胞内のCys濃度が上昇して も、GCLが正常に機能しないためにγ-ECへの変換が抑制されるので、健全な細胞のようなGSHの補給は期待できないと考えられる。外部から投与したγ-ECが細胞内に取り込まれれば、GCLが触媒する第１反応を経ずにGSが触媒する第２反応によりGSHへ変換されるので、このようなGCLの活性調節機構が破綻している老化した細胞や慢性疾患の細胞においても、GSHのホメオスタシスの維持ができると考えられる。実際に、近年細胞や個体レベルで外部からのγ-ECの投与において細胞内のGSHが上昇することや、抗酸化機能が認められたとする研究報告が認められるようになり、このような外部からのGSH投与では期待できない作用が注目されている。しかしながら、未だγ-ECの分子レベルでの作用機構や生体内での動態についてはほとんど研究が行われておらず、今後の詳細な解析が待たれるところである。こういった研究が進まない一因として、γ-ECの安定な供給が困難であることが挙げられる。加えて、γ-ECの医薬品や食品、化粧品の機能性成分としての有用性が認められたとしても、現状の製造方法では高コストのために製品化に向けた工業生産は困難と言える。

γ-ECは前述した通り細胞内における濃度が非常に低く5～10 μM程度であることから、GSHや主要なアミノ酸の工業生産に用いられている発酵法による生産が難しく、試薬として市販されているγ-ECは化学合成法によってGluとCysから製造されている。したがって、供給量はGSHに比べて圧倒的に少なく、試薬レベルでの単位重量当たりの価格はGSHの500～1,000倍となる。

そこで本研究では、まずγ-ECの安価で安定な供給を目指し、GSHをγ-ECへ変換することができるラン藻由来の酵素、NsPCSを用いた新規生産系の構築を図った。次に、これまでほとんど知見がないγ-ECの分子レベルでの作用機構や動態の解明に向けた基礎研究として、細胞内外のGSHの代謝酵素、特にその機能と細胞内濃度調節に関わる酵素に対する反応性を解析した。

第一章においては、NsPCSの反応条件の最適化を行い、また本条件において100 mMという高濃度のGSHを高収率で γ-ECへ変換できることを明らかにした。NsPCSは、補因子等の添加を必要とせず、また生成物阻害を起こさずに GSHを完全にγ-ECへ変換できることから、本研究で得られた知見は本酵素を用いたGSHを原料とするγ-ECの新たな生産系の構築に向けて、非常に有用な知見であると考えられる。

そこで第二章においては、工業生産に堪えるGSHを原料とするγ-EC生産を可能にするために、固定化NsPCSを用いた生産系の構築を図った。その結果、セルロースを担体としたアミド結合法を用いた場合に、NsPCSの活性を維持したまま安定に固定化できることを明らかとした。さらにセルロースシートに固定化したNsPCSは担体として、遊離酵素と同様に液体窒素中で安定に保存できること、活性を低下させることなく少なくとも５回のバッチ式による繰り返し使用によって100 mMのGSHをγ-ECへ変換できること、カラム型セルロースモノリスに固定化したNsPCSは、少なくとも10日間連続して安定に100 mMのGSHをγ-ECへ変換できることを確認した。いずれの生産方法においても高い生産性と容積効率が得られ、安価で安定なγ-EC生産系として実用的な生産への応用が期待できる。

第三章では、γ-ECの生体内での作用や動態に関する研究の一環として、GSHの機能と細胞内濃度調節に関わる glutathione peroxidase (GPx)、glutathione reductase (GR)、glutathione-S-transferase (GST)及びγ- glutamyl transferase (GGT)に対する反応性の解析を行った。その結果、γ-ECは細胞内でGSHを基質として活性酸素の消去を担うGPx及びGSH抱合による異物代謝を担うGSTの基質となるが、酸化型γ-ECは細胞内で酸化型GSHを還元型に戻す反応を担うGRの基質とならないことを確認した。さらに、γ-ECと酸化型γ-ECは、GSHと酸化型GSHのγ-Glu-Cys結合を加水分解するGGTの良好な基質となることを初めて明らかにした。これらの結果から、外部から投与したγ-ECは、血漿中から細胞内へ取り込まれてGSH濃度を上昇させるだけではなく、血漿中でGGTにより分解されてGluとCysとなり、これらが細胞内に取り込まれてGSHの生合成に用いられることにより、GSHの機能を補完・強化し、さらに細胞内のGSHのホメオスタシスを維持する働きを示すと考えられる。

今後本研究で得られた知見をもとにγ-ECの安価で安定な供給が実現するとともに、その分子レベルでの作用機構や動態の解析が進むことにより、優れた抗酸化機能を有する物質として、老化防止や慢性疾患の予防や治療に向けた医薬品や、食品、化粧品等へ広く利用されることが期待される。

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