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Importance of methodology in the evaluation of renal mononuclear phagocytes and analysis of a model of experimental nephritis with Shpl conditional knockout mice.

渡辺, 光治 ワタナベ, ミツハル Watanabe, Mitsuharu 群馬大学

2020.05.31

概要

【背景】
　組織常在性のマクロファージ、樹状細胞、単球は単核食細胞（mononuclear phagocytes：Mophs）と呼ばれ、組織の恒常性維持に重要な役割を果たしている。腎臓における単核食細胞（renal Mophs：rMophs）の存在は約20年前から知られており、病態への関与も含めて多くの研究が行われている。rMophsに関する知見は、フローサイトメトリー（FCM）を用いた解析から得られたものが多いが、rMophsのFCM解析においては、統一のプロトコールが存在しないため、研究間で結論が一貫していないことも多い。特にrMophsを単離する際に用いられるコラゲナーゼの有無は細胞の収量に大きく関与することが想定されている。また、FCM解析においてrMophsを同定するアルゴリズムは、研究者間による差異が大きい。中でも、腎障害時には腎臓内へ好中球が強く流入するため、rMophsを同定する際に好中球を除外することは重要である。rMophsは多くの場合、単球・マクロファージの特異的マーカーであるF4/80,CD11b,Ly6C、あるいは樹状細胞のマーカーであるCD11cの発現に基づいて同定されるが、CD11bやLy6Cは好中球にも共通して発現が認められる細胞表面抗原であるため、rMophsを同定するアルゴリズムにおいては、好中球を同定して除外することが重要となる。しかし、これまでに腎障害のマウスモデルとして多くの解析が行われている腎虚血再灌流障害モデルや片側尿管結紮モデルなどにおいては、rMophsのFCM解析に際して、好中球を除外していない報告も存在しており、実験結果の解釈に混乱が見られている。このような状況から、rMophsのFCM解析においては、適切な実験手法の確立が重要と考える。

【目的】
　本研究では、rMophsのFCM解析における適切な実験手法を確立することを目的とした。また確立した手法を用いて、自己免疫性腎炎におけるrMophsの関与について検討を行った。

【方法】
　コラゲナーゼによる酵素処理がrMophsの単離に与える影響を、C57BL/6マウスの腎臓を用いて検証した。また、F4/80、CD11b、CD11c、Ly6C抗原の発現を指標にしてrMophsのFCM解析を行ったが、この時、好中球の特異的マーカーであるLy6Gを用いて、好中球のrMophs分画への混入の程度を検討した。さらにこれらの検討をもとに、rMophsのFCM解析に最適な好中球を除外するアルゴリズムを確立した。また、CD11c特異的Shp1欠損マウス（Shp1 CKOマウス）を用いて、rMophsの病態への関与を検討した。Shp1 CKOマウスは樹状細胞のマーカーであるCD11cを発現する細胞において、抑制性シグナル伝達分子のShp1を特異的に欠損させた遺伝子改変マウスであり、加齢に伴い自己免疫性腎炎を自然発症する特徴を有する。本研究では、腎炎発症前の若年Shp1 CKOマウスにウシ血清アルブミン（BSA）を免疫することによる誘導される実験的腎炎を用いて、今回我々が確立した実験手法の有効性を確認した。

【結果】
　rMophsの単離に際しコラゲナーゼ処理を用いることで、その収量が著明に増加した。特にF4/80high rMophsが有意に増加した。また、Ly6Gを指標に好中球を同定すると、CD11b+Ly6C+ rMophsの中にはLy6G陽性細胞が約30%混入することが判明した。また、これらのLy6G陽性細胞をメイ・ギムザ法により染色して観察したところ、好中球に特徴的な形態を示すことが確認できた。これらの結果から、rMophsのFCM解析においては、コラゲナーゼを用いて腎臓を処理すること、そして、Ly6Gを用いて好中球を除外することが重要であることが明らかになった。また、Shp1 CKOマウスはBSAを用いた実験的腎炎に感受性を示した。腎炎を発症したShp1 CKOマウスを用いて、今回確立したFCM解析を行うと、F4/80high rMophsが有意に増加していることが明らかになった。

【考察】
　rMophsのFCM解析では、コラゲナーゼ処理による細胞の単離が重要なステップであり、特にF4/80high rMophsの単離には必須であった。すなわちコラゲナーゼを用いずにrMophsを解析した場合、rMophsの重要な亜分画が取得できず、解析結果に重大な影響を及ぼすものと考えられた。さらに、好中球を除外するアルゴリズムを適応しないでFCM解析を行うことは、好中球が混入したrMophsを解析することとなり、実験結果の混乱要因になると思われた。また、確立した方法によるShp1 CKOマウスを用いた解析では、F4/80high rMophsが腎炎の発症に関与している可能性が示唆された。今回我々の確立した解析法は、rMophsのFCM解析に有用な方法であることが判明し、腎炎の病態解明においては重要な手法となることが期待される。

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