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遺伝子組換えブタを効率的かつ安定的に生産する遺伝子組換え技術開発に資する研究

山下 司朗 東北大学

2020.03.25

概要

ブタはヒトと臓器サイズなどの解剖学的類似点や生理学的機能、遺伝学的な近さから実験動物として需要が高まってきている(Whyte and Prather, 2011; Walters and Prather, 2013)。これまでにヒト疾患研究を目的とし、遺伝子組換えにより癌(Sieren et al., 2014)、高脂血症(Davis et al., 2014; Li et al., 2016)、免疫不全(Ito et al., 2014)、筋ジストロフィー(Klymiuk et al., 2013)等になる遺伝子組換えブタが開発されてきたが、これらの遺伝子組換えブタは遺伝子組換え細胞を用いた体細胞核移植(SCNT)という非常に高度な技術が必要であったため、その作出効率は非常に低い状況にあった。

近年、ゲノム編集技術により遺伝子配列を改変することのできる Zinc Finger Nuclease (ZFN)(Kim, Cha and Chandrasegaran, 1996)、transcription activator-like effector nuclease (TALEN)(Christian et al., 2010) 、 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9）(Jinek et al., 2012; Cong et al., 2013)を受精卵へマイクロインジェクションにより注入することで、様々な生物において簡便に遺伝子組換え動物を作出できることが示されている (Mashimo et al., 2013; Wang et al., 2013, 2015; Chen et al., 2015)。また、エレクトロポレーションを利用し、より簡便に導入する方法も開発されている(Kaneko et al., 2014; Kaneko and Mashimo, 2015; Tanihara et al., 2016)。ゲノム編集による遺伝子破壊は、CRISPR/Cas9 等に切断された DNA 末端において非相同末端結合（NHEJ）修復が行われる際の修復エラーにより引き起こされ、この時に導入される変異はランダムな欠失挿入を伴う。これらの技術によりブタにおいても効率よく遺伝子組換えブタが作られるようになったが、十分な遺伝子変異が導入されないことや、変異パターンが異なる複数の遺伝子組換え細胞から構成されるモザイク個体となる等の問題が残っている。このモザイク変異の問題はブタ(Sato et al.,2015; Wang et al., 2015; Tanihara et al., 2016)、ウシ(Bevacqua et al., 2016)、非ヒト動物(Chen et al., 2015)を含む中大型動物で特に大きな課題となっており、齧歯類と比べモザイク変異が生じやすいことが知られている(Lamas-Toranzo et al., 2018)。

遺伝子組換えにより作られた癌(Sieren et al., 2014)、免疫不全(Ito et al., 2014)などに代表されるヒト疾患モデル動物は症状が強く現れるために長期間飼育することが難しく、遺伝子組換え動物同士の交配による繁殖は困難である。このようなことから、症状を示す対象遺伝子ホモ改変動物の作出は症状が強く表れることのないヘテロ改変動物同士の交配により行っていたが、作出効率が 1/4 と低いため解析に必要な個体数をそろえることは困難であった。また、受精卵でのゲノム編集や遺伝子組換え細胞を用いた SCNT により都度個体を作出する方法も考えられるが、これらの方法では作出効率が非常に低いのが現状である。そのため、遺伝子組換え動物を安定生産するためには遺伝子組換えによる表現型を示さない個体から特定遺伝子を改変した生殖細胞を作出し、交配による増産を行うことが有効と考えられる。先の研究において、Nanos3 遺伝子をノックアウト（KO）することにより生殖細胞を特異的に欠損する以外個体の表現型に異常が認められない胚と、正常な胚を混合したキメラを作出することで、正常な胚に由来する生殖細胞を形成する個体を得られることが示されており(Ideta et al., 2016)、特定遺伝子を欠損した生殖細胞を持つが遺伝子組換えによる

表現型を示さない正常個体を作出できる可能性が示されている。しかし、この方法には Nanos3 KO による生殖細胞欠損胚とヒト疾患となる特定遺伝子組換え胚の 2 つを作出し、さらにこの2 つを混合したキメラ胚を作出するという煩雑な操作が必要である。加えて、この方法では作出された個体はキメラではなくどちらか片方の胚に由来する個体となることも多い。一方、マウスにおいて生殖細胞特異的発現プロモーターと部位特異的組換えシステムを利用したコンディショナルノックアウト（CKO）マウスが作出されており(O’Gorman et al., 1997; Lei et al., 2010)、遺伝子組換えによる

表現型を示さない個体から特定遺伝子を欠損した精子を作り、ヒト疾患動物のように維持、繁殖が難しい個体を安定生産する試みが行われている。この方法を利用することで、1 種類の遺伝子組換え胚を作出し、胚移植することで目的とする精子形成過程 CKO 動物が作出できると考えられる。特に TEX101 は精子形成過程で強く発現しており(Takayama et al., 2005)、効率よくCKO できることが示されている(Lei et al., 2010)。

本研究においては遺伝子組換えブタの生産性向上を目指し、ブタ受精卵でのゲノム編集におけるモザイク胚低減を目的とし、第 2 章としてブタ受精卵への CRISPR/Cas9導入による遺伝子組換え胚作出と Trex2 共導入によるモザイク胚低減を実施した。また、遺伝子組換えブタの交配による安定生産を目指し、第 3 章として TEX101 プロモーターおよび部位特異的組換えシステムを用いた精子形成過程特異的遺伝子組換え技術の確立を試みた。

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参考文献

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