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P2Y6受容体は尿酸結晶による炎症反応を制御する

浦辻, 秀弥 東京大学 DOI:10.15083/0002002667

2021.10.21

概要

尿酸結晶（monosodium urate crystals：MSU）は痛風の原因物質としてよく知られている。痛風では関節に尿酸結晶が沈着し、単球やマクロファージに貪食された尿酸結晶がインフラマゾームを活性化することにより、interleukin-1（IL-1）やtumor necrosis factor-α（TNF-α）、IL-6、IL-8/CXCL8といった炎症性サイトカインの産生を誘導し、急性炎症を誘発する。また、尿酸は細胞が傷害を受けた際や感染した際に放出され、それらが過剰になると、尿酸結晶を形成し、これら尿酸結晶は、免疫機構を活性化する危険信号（danger signal）として作用することが知られている。表皮は身体の最外層に位置し、紫外線や物理的刺激といった多様な刺激や抗原に頻繁に曝されている。さらに、アトピー性皮膚炎や接触皮膚炎、扁平苔癬、中毒性表皮壊死症といった多くの炎症性皮膚疾患において、表皮角化細胞のアポトーシスやネクローシスが認められる。それゆえ、表皮角化細胞では細胞傷害が頻繁に認められ、その結果として、尿酸結晶が表皮内に容易に沈着する可能性がある。また、尿酸は核酸の最終代謝産物であるため、表皮の過増殖を示す皮膚疾患においても過剰になる可能性があり、実際、表皮の過増殖を示す乾癬皮疹部の表皮において、尿酸結晶が検出されている。しかしながら、表皮において、尿酸結晶が炎症を誘発する正確なメカニズムについては不明である。そこで、我々は、尿酸結晶によって表皮から誘導される炎症性サイトカインの産生メカニズムについて検討した。

　単球では、尿酸結晶がIL-1βやIL-18を含む様々な炎症性サイトカインの産生を誘導することが報告されていることから、表皮角化細胞においても検討した結果、尿酸結晶刺激により少量のTNF-α、IL-1β及び多量のIL-8/CXCL8、IL-18、IL-6の産生が誘導され、単球だけでなく、表皮角化細胞においても尿酸結晶が炎症性サイトカインの産生を誘導することが示された。次に、尿酸結晶によって誘発される炎症反応において、IL-1受容体が重要であることが知られているため、表皮角化細胞での重要性を検討した。IL-1受容体アンタゴニスト（IL-1receptor antagonist：IL-1RA）によって、尿酸結晶により誘導される表皮角化細胞からのIL-8/CXCL8及びIL-6産生は有意に抑制されたことから、表皮角化細胞においてもIL-1が中心的な役割を担うことが示された。IL-1のなかで、単球やマクロファージなどからは主にIL-1βが産生されるが、表皮角化細胞を含む上皮細胞からは主にIL-1αが産生される。そのため、尿酸結晶刺激による表皮角化細胞からのIL-1α産生について検討したところ、IL-1βよりも多量のIL-1αの産生が確認された。また、抗IL-1β抗体ではIL-8/CXCL8及びIL-6産生が抑制されない一方で、抗IL-1α抗体はこれらの産生を有意に抑制した。また、caspase-1阻害剤は尿酸結晶によるIL-1β産生を阻害するものの、IL-1α、IL-8/CXCL8及びIL-6産生を抑制しなかった。従って、表皮角化細胞においては、尿酸結晶刺激によって誘導されるIL-8/CXCL8やIL-6といった二次的なサイトカイン産生には、IL-1αがIL-1受容体に結合することによるシグナルが重要であることが示された。

　次に、尿酸結晶がどのようにして表皮角化細胞を刺激するかについて検討した。表皮角化細胞はメラノソームを貪食できることから貪食能は有するものの、電子顕微鏡観察によって表皮角化細胞による尿酸結晶の貪食像は確認できず、貪食阻害剤であるcytochalasin D処置によってもIL-1α、IL-8/CXCL8及びIL-6産生は抑制されなかった。そのため、表皮角化細胞は、貪食細胞とは異なるメカニズムにより尿酸結晶を認識しているのではないかと考えた。そこで、表皮角化細胞において、尿酸結晶による反応に関与する細胞膜受容体の特定を試みた。尿酸がadenosine triphosphate（ATP）や核酸といったプリン体の分解物であること、P2受容体がATPなどの細胞外のヌクレオチドを認識する受容体であることから、尿酸結晶刺激による表皮角化細胞からのサイトカイン産生におけるP2受容体の関与を検討した。P2受容体アンタゴニストであるsuramin及びP2Y受容体アンタゴニストであるreactive blue 2（RB2）の作用を検討した結果、suramin及びRB2はIL-1α、IL-8/CXCL8及びIL-6産生をほぼ完全に抑制した。これらの結果から、表皮角化細胞における尿酸結晶による刺激はP2Y受容体により制御されていることが明らかとなった。続いて、表皮角化細胞において尿酸結晶刺激に対して反応性のあるP2Y受容体を特定するために、表皮角化細胞におけるP2Y受容体の発現を検討した。Reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）の結果、表皮角化細胞にはP2Y1、P2Y2、P2Y6、P2Y11受容体の発現が認められ、尿酸結晶刺激により、P2Y6、P2Y12、P2Y14受容体の発現が増加し、その他のサブタイプの発現に変化はなかった。これらの受容体のなかで、尿酸結晶刺激により発現が増加すること、suraminとRB2はP2Y6受容体に対するアンタゴニスト作用を有する一方でP2Y14受容体に対するアンタゴニスト作用はないことから、我々はP2Y6受容体に注目した。まず、P2Y6受容体発現が尿酸結晶刺激によりmRNA及びタンパク質レベルで増加することをリアルタイムRT-PCR及び免疫ブロットにより確認した。次に、尿酸結晶刺激による表皮角化細胞からのサイトカイン産生に対するP2Y6受容体の役割を検討するために、P2Y6受容体特異的アンタゴニストであるMRS2578及びP2Y6受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用した。MRS2578は尿酸結晶により誘導される表皮角化細胞からのIL-1α、IL-8/CXCL8及びIL-6産生を有意に阻害し、P2Y6受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドもサイトカイン産生を有意に抑制した。さらに、P2Y6受容体small interfering RNA（siRNA）によりIL-1α及びIL-8/CXCL8産生が有意に抑制された。P2Y6受容体が活性化することにより、細胞内でphospholipase C（PLC）が活性化することが知られているが、PLC阻害剤であるU-73122は尿酸結晶により誘導される表皮角化細胞からのIL-1α、IL-8/CXCL8及びIL-6産生を有意に阻害することも確認した。これらの結果より、表皮角化細胞における尿酸結晶誘発の炎症性サイトカイン産生において、P2Y6受容体‐PLC経路が重要な役割を果たすことが示された。

　痛風の急性炎症では、単球が尿酸結晶刺激によって多量のIL-1βを産生することが報告されているが、この単球からのIL-1β産生においてもP2Y6受容体が重要であるかを検討した。ヒト単球様細胞（THP-1細胞）におけるP2Y6受容体発現は尿酸結晶刺激により増加し、P2Y6受容体特異的アンタゴニストであるMRS2578はTHP-1細胞における尿酸結晶誘発のIL-1β産生をほぼ完全に抑制した。さらに、P2Y6受容体アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、THP-1細胞における尿酸結晶誘発のIL-1β産生は有意に抑制され、また、U-73122によってもIL-1β産生は有意に抑制された。以上の結果より、表皮角化細胞だけでなく、単球においても、尿酸結晶誘発の炎症反応がP2Y6受容体‐PLC経路により制御されていることが示された。

　最後に、我々はin vivoでもP2Y6受容体が尿酸結晶誘発の炎症に対して反応性を有するかを検討した。マウスエアポートモデルにおいて、尿酸結晶により誘導されるエアポーチ内の好中球数増加に対し、MRS2578を処置することにより、その好中球浸潤は有意に抑制された。また、尿酸結晶誘発のマウス腹膜炎モデルにおいても、MRS2578によって腹腔内への好中球浸潤は有意に抑制された。これらの結果から、in vivoにおいてもP2Y6受容体が尿酸結晶誘発の炎症反応に重要な役割を果たすことが示された。

　以上の実験結果から、表皮角化細胞と単球のいずれにおいても、P2Y6受容体が尿酸結晶による炎症反応を制御すること、また、表皮角化細胞においては、単球とは異なり、尿酸結晶による炎症性サイトカイン産生がIL-1α‐IL-1受容体経路により制御されていることが示唆された。従って、P2Y6受容体シグナル経路は尿酸結晶が関連する炎症性疾患の治療ターゲットとなる可能性があり、痛風結節以外の皮膚疾患に関しては、表皮角化細胞の過増殖やアポトーシス、ネクローシスの亢進が認められるような乾癬やアトピー性皮膚炎も新たな治療ターゲットとなる可能性が考えられた。

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