酵母におけるセラミドの非小胞輸送に関する研究
概要
博士論文
酵母における
セラミドの非小胞輸送に関する研究
令和 3 年 3 月
広島大学大学院生物圏科学研究科
池田敦子
博士論文
酵母における
セラミドの非小胞輸送に関する研究
令和 3 年 3 月
広島大学大学院生物圏科学研究科
生物機能開発学専攻
池田敦子
目次
第1章
緒言 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 3
第2章
実験材料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 12
第3章
実験操作 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 18
第4章
実験結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23
1. TCB 遺伝子破壊株における表現型の解析 ・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23
1-1. TCB 遺伝子破壊株は myriosin に対して薬剤感受性を示す ・・・・・・・・ 23
1-2. TCB 遺伝子破壊株は液胞の断片化を示す ・・・・・・・・・・・・・・・・ 23
2.Tcb タンパク質の局在性の解析 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 27
2-1.過剰発現させた Tcb3-GFP は小胞体-ゴルジ体コンタクトサイトに局在し、
その局在は C2 ドメインおよび Tcb1、Tcb2 を必要とする ・・・・・・・・ 27
2-1-1. 過剰発現させた Tcb3-GFP は cER と nER の両方に局在し、
C2 ドメイン依存的にドットを形成する
2-1-2. Tcb3 のドット状の局在は、Tcb1 と Tcb2 を必要とする
2-1-3. 過剰発現させた Tcb3-GFP のドットは小胞体-ゴルジ体
コンタクトサイトに局在する
2-1-4. PI4P の増加は Tcb3-GFP のドット形成を促進する
2-1-5. Tcb3-positive なチューブ状の構造について
2-2.ネイティブプロモーター下で発現した Tcb3-GFP の小胞体-ゴルジ体
コンタクトサイトへの局在は小胞体ストレスによって増加する ・・・・・・ 35
2-2-1. ネイティブプロモーター下で発現した Tcb3-GFP のドットは、
tunicamycine の添加によって増加する
2-2-2. tunicamycin の添加によって形成された Tcb3-GFP のドットは
小胞体-ゴルジ体コンタクトサイトに局在する
3.小胞体-ゴルジ体コンタクトサイトの形成に関する解析 ・・・・・・・・・・・ 39
3-1. Tcb タンパク質の C2 ドメインは小胞体-ゴルジ体コンタクトサイトの形成に
機能する ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 39
3-1-1. Tcb タンパク質の欠損により小胞体-ゴルジ体コンタクトサイトが減少する
3-1-1. C2 ドメインをもつ Tcb3 の過剰発現は小胞体-ゴルジ体コンタクトサイト
を増加させる
1
4.小胞輸送における Tcb タンパク質の機能解析 ・・・・・・・・・・・・・・・・ 42
4-1. Tcb タンパク質は COPII 小胞輸送に関与しない
・・・・・・・・・・・・・ 42
5.セラミド非小胞輸送における Tcb タンパク質の機能解析 ・・・・・・・・・・・ 44
5-1.Tcb タンパク質はセラミドの非小胞輸送に必要である ・・・・・・・・・・ 44
5-1-1. TCB 遺伝子の破壊はセラミドの非小胞輸送依存的な IPC 合成を減少させる
5-1-2. TCB 遺伝子の破壊は、IPC 合成活性およびセラミド合成に影響を与えない
5-2.Tcb3 の過剰発現は SMP ドメインおよび C2 ドメイン依存的にセラミドの
非小胞輸送を促進させる ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 50
5-2-1. Tcb3 の過剰発現は小胞輸送非依存的な IPC 生合成を促進する
5-2-2. Tcb3 による IPC 合成の促進には SMP および C2 ドメインが必要である
6.セラミド非小胞輸送と他の細胞機能との関係に関する解析
・・・・・・・・・ 53
6-1.セラミド非小胞輸送はセラミドの蓄積を防ぐ役割を担う ・・・・・・・・ 53
6-1-1. TCB 遺伝子の欠損は LD 形成を促進する
6-1-2. Tcb3 の過剰発現は sec12 変異株における LD 形成の増加を抑圧する
6-1-3. TCB 遺伝子の欠損は TAG の量には影響を与えない
第5章
考察
第6章
参考文献 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 63
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 57
謝辞 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 71
2
第1章
緒言
生体膜は、固有の脂質組成を有しながら多種類の脂質が不均一かつ複雑に配置されて
おり、細胞やオルガネラの形態維持や機能と密接に関連している。生体膜の機能性は、
生体膜上における脂質分子の配向や非対称性、分布や動態、脂質間相互作用、膜の相分
離構造や膜同士の接触部位の形成といったダイナミックな膜の構造変化がタンパク質
の構造や機能と複雑に絡み合うことで、制御されている。つまり、生体膜で行われる物
質輸送や情報伝達、酵素による物質代謝などの重要な生命現象に、脂質が深く関与して
いると考えられる。したがって、細胞が生命活動を正常に行う上で、細胞膜の脂質の存
在量や分布は細胞内外の環境変化に応じて適切に保たれている必要がある。そのために、
脂質合成の場である小胞体から機能すべき場所への輸送や選別は厳密に制御されてい
ると考えられる。近年、脂質の合成と代謝、およびその調節機構はその全貌が明らかに
されつつあるのに対し、輸送や選別のメカニズムについては未だ多くが謎のままである。
スフィンゴ脂質の細胞機能
スフィンゴ脂質は生体膜を構成する主要分子のひとつである。スフィンゴ脂質とは基
本骨格にスフィンゴイド塩基をもつ複合脂質の総称であり、グリセロリン脂質やステロ
ールと共に動物や植物、酵母などの真核細胞の膜を構成している。さらに、スフィンゴ
脂質はステロールとともに秩序液体相(liquid-ordered 相、Lo ドメイン)であるラフトと
呼ばれる膜ドメインの形成に重要であることが知られている。Lo ドメインは液体無秩
序相である liquid-disordered (Ld)ドメインと比べて、膜の厚みが厚く、流動性は低い。ラ
フトには受容体タンパク質や glycosylphosphatidylinositol (GPI)アンカータンパク質など
が集積していることから、このドメインは生体膜上でシグナル伝達や細胞内小胞輸送に
おける積み荷の選別に関与していると推測されている [1] [2]。
スフィンゴ脂質は生体膜を構成するだけでなく、それ自身がシグナル伝達因子として、
細胞内の生命現象において多彩な役割を果たしている。スフィンゴイド塩基はストレス
応答やアクチン細胞骨格、細胞周期の調節などに関与する [3] [4] [5]。また、スフィン
ゴ脂質の中心的分子であるセラミドは、増殖抑制の主要なメディエーターとして、また
はアポトーシスやマイトファジー、細胞周期の停止や老化といった腫瘍抑制のための細
胞プログラムにおいて機能する [6] [7]。
細胞内におけるセラミドの濃度調整は、細胞の運命を決定する上で非常に重要である。
セラミドの輸送やスフィンゴ脂質代謝に異常が起こると、セラミドの過剰な蓄積によっ
て、細胞の機能障害や細胞死が引き起こされる [8] [9]。このようにセラミドの量が一時
的に増加した時に、脂質毒性を防ぐメカニズムの一つとして、セラミドの複合スフィン
ゴ脂質への変換を促進することが考えられる。また、セラミド分解酵素による分解も細
胞内のセラミド量を減少させるために重要な役割を持つことが推測できる [10] [11]
3
[12]。加えて、動物細胞を用いた解析から、セラミドはアシルセラミドへと変換され、
脂肪滴(lipid droplets, LDs)に取り込まれることでセラミドの有毒な蓄積を防ぐことが示
唆されている [13]。酵母にも同様の機構が存在することが提唱されているが [14] [15]、
その証明には至っていない。
スフィンゴ脂質の生合成とその制御機構
モデル生物である出芽酵母においては、スフィンゴ脂質の合成経路やそれに関わる酵
素、代謝産物の多くが既に明らかにされている(Fig.1)。スフィンゴ脂質の生合成過程は、
小胞体において、serine palmitoyltransferase (SPT)によるセリンとパルミトイル CoA の縮
合反応から始まり、3-keto sphinganine、dihydrosphingosine (DHS)および phytosphingosine
(PHS)が合成される。さらに、DHS から dihydroceramide、PHS からは phytoceramide が
合成される。小胞体で合成されたセラミドは、その後ゴルジ体へと輸送され、ゴルジ体
に 局 在 す る 酵 素 Aur1 に よ っ て 複 合 ス フ ィ ン ゴ 脂 質 の 一 つ で あ る inositol
phosphorylceramide (IPC)へと変換される。そこにマンノースが付加されて mannosylinositol phosphorylceramide (MIPC)、さらにホスホリルイノシトール基が付加されて
mannosyl-di-inositol phosphorylceramide (M(IP)2C)へと反応が進む。このようにスフィンゴ
脂質の生合成過程や各ステップで働くタンパク質をコードする遺伝子(Fig.1)はほぼ明
らかにされてきている。
さらに、スフィンゴ脂質の合成を調節するメカニズムについても、最近その多くが分
かってきている [16]。スフィンゴ脂質の量は、その合成に関与する主要な酵素が翻訳後
修飾を受けることによって制御されている。細胞膜におけるスフィンゴ脂質の量が低下
すると、target of rapamycin complex 2 (TORC2)が活性化し、Akt タンパク質(PI3K の下
流に位置して細胞機能の制御に関連するキナーゼ)の酵母ホモログである Ypk1 をリン
酸化する [17]。これにより、SPT の負の調節因子である Orm タンパク質がリン酸化さ
れることによってスフィンゴ脂質合成の抑制が解除される [18] [19] [20]。その他のメカ
ニズムとしては、Ypk キナーゼによるセラミド合成の制御 [21]や、Pkh キナーゼの制御
[22]、very-long-chain fatty acid (VLCFA)生合成の制御 [23] [24]など、様々なステップにお
いて制御機構が働いている。また、複合スフィンゴ脂質合成酵素も制御を受けることが
示唆されている [25]。さらに、スフィンゴ脂質代謝における最初の中間体であるセリン
の細胞外からの取り込みが、スフィンゴ脂質ホメオスタシスの維持において重要である
ことも示唆されている [26]。
4
Figure 1. 複合スフィンゴ脂質生合成経路
セラミドの小胞輸送経路と非小胞輸送経路について
複合スフィンゴ脂質の前駆体であるセラミドは小胞体で合成され、セラミドから複合
スフィンゴ脂質の一つである IPC への変換はゴルジ体で行われる。小胞体とゴルジ体は
それぞれの膜によって区画化されているため、セラミドがその間を移動するためには適
切な輸送過程が必要になる。セラミドの輸送は、輸送小胞を介する小胞輸送、およびそ
れを介さない非小胞輸送によって行われることが知られている [27]。セラミドの小胞
輸送は、タンパク質の小胞輸送と同じく Sec タンパク質群および COPⅡ小胞に依存する
輸送である。glycosylphosphatidylinositol (GPI)アンカータンパク質も、小胞体で合成され
た後 COPII 小胞輸送によってゴルジ体を経て、細胞膜表面へと輸送される [28]。この
とき、小胞体において GPI アンカータンパク質が脂質マイクロドメインに集積する [29]
ことによって他のタンパク質との選別を受け、特異的な輸送小胞に乗って運ばれること
が示唆されていた。最近になって、実際にこのような選別が行われていることが、高速
超解像ライブイメージング顕微鏡を用いた観察によって確認された [30]その他の知見
として、GPI アンカータンパク質の輸送にはセラミドの正常な合成が必要である [31]。
また、GPI アンカーの生合成に異常を持つ細胞ではセラミドの蓄積が見られる [32] [33]。
これらのことから、セラミドの小胞輸送と GPI アンカータンパク質の輸送は相互に調
節し合う関係であると考えられる。
さらに、ステロール結合タンパク質の oxysterol binding protein (OSBP)と、酵母 Osh
(OSBP-homolog)タンパク質がセラミドの小胞輸送を制御することも明らかにされてい
る [34]。OSBP は pleckstrin homology (PH)ドメイン、two phenylalanines in an acidic tract
(FFAT)モチーフ、OSBP-related ligand-binding domain (ORD)という 3 つの機能性ドメイン
5
からなるタンパク質である(Fig. 2) [35] [36]。PH ドメインが phosphatidylinositol 4phosphate (PI4P)と結合することにより、OSBP はゴルジ体へ局在化される。FFAT モチー
フは小胞体の膜タンパク質 VAP(酵母細胞では Scs2)と相互作用し、小胞体への局在に
必要な領域である。さらに、ORL はステロール結合ドメインである。酵母 Osh タンパ
ク質は、OSBP と同様のステロール結合ドメインを有する OSBP-related protein (ORP)の
ホモログであり、Osh1-Osh7 が存在する [37]。
Figure 2. タンパク質のドメイン
Osh2, Osh3, Osh4 が欠損した osh2Δ3Δ4Δでは、セラミドの小胞輸送に障害が見られ
る。しかしながら、osh2Δ3Δ4Δにおいて GPI アンカータンパク質である Gas1 の小胞
体への蓄積は見られなかった。このことは、Osh タンパク質が関与しているセラミドの
輸送は、GPI アンカータンパク質との共輸送とは異なる輸送である可能性を示唆してい
る。一方、小胞輸送の初期ステップである輸送小胞の形成に働く SEC12 遺伝子の変異
による表現型が、Osh タンパク質の欠損によって抑圧された。このことは、Sec12 の機
能に対して Osh タンパク質の存在がマイナスに働いていることを意味しており、Osh タ
ンパク質は輸送の初期ステップにおいては負の制御因子であることを示唆している。こ
れにより、Osh タンパク質はセラミドの小胞輸送において、正の制御因子であると同時
に、初期ステップにおいては負の制御因子である、という異なる 2 つの機構による制御
を行っている可能性が示唆された(Fig. 3)。ただし、セラミドが GPI アンカータンパク質
に富む小胞へパッケージングされるのを Osh タンパク質が助けている可能性も排除さ
れていないことから、GPI アンカータンパク質を含まずセラミドのみを運ぶ小胞が存在
するかは仮説の域を出ない。
6
Figure 3. Osh タンパク質による輸送制御機構
一方で小胞を介さない輸送は、ATP を必要としない経路であること、細胞質タンパク
質を必要とすること、オルガネラ膜同士の接触を必要とすることが示唆されている
[27]。ヒト細胞においては、セラミドを特異的に輸送するタンパク質として ceramide
transport protein (CERT)が知られている [38] [39]。CERT はセラミドを輸送するために必
要な 3 つのドメインから構成されており、OSBP と同様の PH ドメインと FFAT モチー
フに加えて、START ドメインをもつ(Fig.2) [39]。START ドメインは小胞体膜からセラ
ミドを引き抜き、ゴルジ体への受け渡しに機能するドメインである。CERT はステロー
ル結合タンパク質 OSBP とともにセラミド輸送を調節することが示唆されている [40]
[41]。真核細胞のモデル生物である出芽酵母においても、これと類似したセラミド非小
胞輸送メカニズムが存在すると推測されるが、酵母細胞には CERT のホモログが存在し
ないことから [42]、セラミドの非小胞輸送に関与する因子は長らく不明であった。
セラミド非小胞輸送における membrane contact sites の役割
細胞内には異なるオルガネラの膜同士が非常に近接している部分があり、この領域は
membrane contact site (MCS)と呼ばれる。これまで、オルガネラはそれぞれのオルガネラ
膜によって区画化されているため、独立した存在であるように捉えられてきた。しかし
ながら、実際は、MCS における膜同士の直接的な接触を介して、協調的な機能を発揮
していると推察できる。そのため MCS は近年、オルガネラ間のコミュニケーションの
場として大きな注目を集めている。MCS の役割としては、細胞の機能に重要な脂質代
7
謝、シグナル伝達、イオンの調節、低分子の輸送やオルガネラの形態など様々な生命現
象に関与していると考えられている。MCS はあらゆるオルガネラ間で見られ、特に小
胞体は非常に発達した網目状の構造を持つことから、様々なオルガネラと MCS を形成
している。代表的な MCS として、核周辺の小胞体と液胞の間の nucleus–vacuole junction
(NVJ)、小胞体とミトコンドリアとの endoplasmic reticulum and mitochondria encounter
structures (ERMES)、細胞膜辺縁の小胞体を細胞膜に繋ぎ止める ER-PM contact sites など
が知られている(Fig.4)。ここ数十年で MCS の形成に関わる因子も次々と同定されてき
ている。最近では、Tcb タンパク質を含む 7 つの tether タンパク質(Tcb1, Tcb2, Tcb3, Scs2,
Scs22, Ist2, Ice2)が、小胞体と細胞膜のコンタクトサイトを形成する機能を持つことが報
告されている [43] [44]。この小胞体-細胞膜コンタクトにおいては、MCS は小胞体に
局在する Sac1 による細胞膜上の PI4P を PI に変換する機能の促進に機能している。ま
た、Nvj2 は核と液胞が接する領域である NVJ に多く存在するタンパク質として報告さ
れた。この接触領域は、小胞体局在性の Nvj1 と液胞膜局在性の Vac8 によって形成され
ることが知られている [45]。
Figure 4. Membrane Contact Sites
セラミドの非小胞輸経路は、輸送小胞を介さず、ATP 非依存的であるが、オルガネラ
膜同士の接触を必要とすることが示唆されている [27]。近年になって、通常時には NVJ
に局在している Nvj2 が、ストレス条件下で小胞体とゴルジ体の MCS に局在して MCS
形成を促進し、セラミド非小胞輸送に関与することが報告された [14]。Nvj2 は膜貫通
領 域 に よ っ て 小 胞 体 に 局 在 す る 膜 タ ン パ ク 質 で あ る 。 ま た 、 PH ド メ イ ン と
synaptotagmin-like mitochondrial-lipid-binding protein (SMP)ドメインも持つ(Fig.2) [46]。酵
母の膜接触部位には、SMP ドメインを持ったタンパク質が多く局在していることが知
られている [46]。バイオインフォマティクス(生命情報科学)に基づく解析により、SMP
8
ドメインが脂質結合および脂質輸送能をもつ tubular lipid-binding protein (TULIP)ドメイ
ンと相同性をもつことが示唆されたことから、SMP ドメインを有するタンパク質も同
様に、膜接着部位において脂質輸送に関与しているだろうと推察されている [47]。SMP
ドメインの機能は未だ明らかにされていないが、小胞体とミトコンドリアの間での脂質
の交換に関与する可能性が報告されている [48]。
Osh タンパク質の破壊株、osh2Δ3Δ4Δはセラミド輸送に障害を持つため IPC 合成量
が低下している。そのため、IPC 合成阻害剤である aureobasidin A を含む培地では、osh2
Δ3Δ4Δ株は野生株と比べて生育が著しく悪化する [34]。osh2Δ3Δ4Δに高発現させる
ことによって aureobasidin A 感受性を抑圧するタンパク質のスクリーニングから得られ
たのが Nvj2 であった [14]。網羅的な解析において、セラミドとの結合性も示されてい
る [49]。in vivo および in vitro において、小胞輸送が動かない条件下で Nvj2 の高発現が
IPC 合成量を増加させた [14]。また、Nvj2-GFP の過剰発現や、小胞体ストレス誘導時
には Nvj2-GFP は小胞体膜上を移動し、小胞体-ゴルジ体の MCS に局在する。さらに、
小胞体ストレスによって小胞体-ゴルジ体のコンタクトが増加し、このときのコンタク
トの形成には Nvj2 が必要であることが分かった。これらの結果から、Nvj2 は小胞体-
ゴルジ体コンタクトを形成することで、セラミドの非小胞輸送を促進することが示唆さ
れている。
Figure 5. Nvj2 と Tcb3
Tcb タンパク質について
セラミドの非小胞輸送に関わるタンパク質を明らかにすることが本研究の目的であ
る。そこで、セラミド輸送に機能するためにはセラミドと結合する性質を持つであろう
という考えから、セラミドと結合する可能性のあるタンパク質に着目した。以前より、
哺 乳 類 の リ ン 脂 質 加 水 分 解 酵 素 で あ る 細 胞 質 型 ホ ス ホ リ パ ー ゼ A2 (cytosolic
phospholipase A2, cPLA2)の C2 ドメインが、カルシウムイオンに依存してセラミドと結
合することが分かっている [50]。先行研究での無細胞実験系を用いたセラミドの非小胞
輸送系を測定する解析において、キレート剤(EGTA/MnCl2)によって IPC 合成が阻害され
た(未発表)ことからも、カルシウムイオンに依存的な C2 ドメインの特徴はセラミド輸
9
送タンパク質の候補として有力であると考えられた。そこで、酵母遺伝子のデータベース
において C2 ドメインを持つタンパク質をサーチしたところ、Three Calcium and lipid
Binding domains (tricalbin)ファミリーの 3 つのタンパク質 Tcb1, Tcb2, Tcb3 が該当した
(Fig. 2)。 ...