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iPS細胞誘導におけるX染色体再活性化機構の解明

相澤, 志穂 筑波大学 DOI:10.15068/0002005421

2022.10.21

概要

[目的]
 クロマチン構造の形成や構造変換により遺伝子発現が適切に制御され,正常な発生や生命活動が行われる.これらの機構における異常は重大な疾患につながることが報告されている.代表的なクロマチン構造であるユークロマチンからヘテロクロマチンへの構造変換に関しては,X染色体の不活性化をモデルに多くの知見が蓄積している一方,ヘテロクロマチンからユークロマチンへの変換は,未だ多くが不明なままである.本研究では,iPS細胞誘導の過程で起きるX染色体の再活性化(X chromosome reactivation, XCR)をモデルに,ヘテロクロマチンからユークロマチンへの変換機構を解明することを目的とする.
 これまでXCRの検出は,主にRNAFISHや免疫染色により行われてきたが,これらの感度は低く,XCRにおける転写の再開を正しく検出できていないと考えられる.これに対して私は既に,2本のX染色体に存在するSNPを利用し,不活性化X染色体(Xi)からの転写を感度良く定量するSNP cDNA typingを確立している.また本研究室では,多能性の程度を制御しながらリプログラミングを誘導できる3S reprogramming systemを有している.よって,3S reprogramming systemを用いてリプログラミングのスピードを緩め,SNPcDNAtypingを用いてXCRの開始を感度良く捉えることで,XCRの過程をより詳細に解析できると考えた.そこで私は,XCRの過程にある細胞を段階的に回収,⽐較し,転写再開が起きる領域を同定後,その領域に結合する分⼦を同定し,その分⼦の機能解析を元に,XCRにおける転写再開の分⼦機構を明らかにすることを試みた.

[方法]
 まず,3S reprogramming systemを用いて,リプログラミング進行度の異なる細胞を誘導した.SNP cDNA typingを用いてXiからの転写を確認し,転写再開の過程にあると考えられる細胞群を得た.そして,これらの細胞群に対してアレルを読み分けながらRNA-seqを行い,Xiの各領域からの詳細な転写プロファイルを取得し,その結果より転写が再開する領域を特定した.
 さらに,XCRが開始する領域では,転写再開に関わる因子が結合していると考えられるため,ChIP-seqのデータベースを用いて,それらの領域に結合する因子を転写再開関連候補因子として絞り込んだ.これら候補因子の実際のXCRへの関与を確認するために,候補因子を発現制御しながらリプログラミングによるXCRの誘導を行なった.そして,XCRへの関与が確認された分子が,転写再開を引き起こす機構を解析した.

[結果]
 RNA-seqで得られた結果より,Xi上の各遺伝子からの経時的な転写量の変化を求めた.そして全遺伝子の発現変化を元に,転写の再開が早い遺伝子を絞り込んだところ,すべての遺伝子が,X染色体170Mb中の0.5Mbの領域に集中していた.そこで,この領域を転写の再開が起きる領域と結論し,Xtreme(X-tran scriptional reactivation manifesting element)と名付けた.次に,Xtremeに結合するタンパク質を,データベースを用いて確認したところ,KDM1A,KDM4C,NELFA,OTX2,TCF12の5つの候補因子が得られた.これら5つの候補因子を,shRNAにて発現抑制しながらXCR誘導を行ったところ,Kdm1a,Nelfa,Otx2の発現抑制が,有意に転写の再開を促進することが明らかとなった.その中のKDM1Aに着目し,ChIP-seqによりKDM1AのXtremeへの結合を確認したところ,Xtremeの中でも特に転写再開の早い遺伝子のプロモーター,エンハンサー領域において,転写再開に伴うようにKDM1Aの結合がなくなることがわかった.KDM1AはヒストンH3のリジン脱メチル化酵素としての機能を持つため,酵素活性中心に結合するKDM1A阻害剤による転写再開への影響を確認したところ,酵素活性を失う事によりXCRにおける転写の再開が促進されることが明らかとなった.

[考察]
 XCRにおけるKDM1Aの結合変化と,酵素活性の阻害によるXCR促進から,XCR開始には,KDM1Aが転写開始領域から離れ,その酵素活性を失うことが重要であると考えられる.また,XtremeはX染色体全域と比較して,オープンな構造を取っており,さらに同様の遺伝子制御を受けると考えられている,単一TAD(Topologically associating domain)に含まれていることが,この領域に含まれる複数の遺伝子の転写再開が起きやすい理由となっている可能性がある.

[結論]
 本研究では,定量的なXCR検出系を用いて,XCR進行度の異なる細胞を回収したことにより,リプログラミングにおいてXCRが開始するXtreme領域を明らかにした.Xtremeはオープンな構造を持つため,様々な分子の結合が容易であると考えられる.中でも転写再開に関わる因子がXtremeに結合し,KDM1Aの結合が外れることで,ヒストンメチル化が増加し,転写が再開すると考えられる.

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