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Expression of Vascular Endothelial Growth Factor by Retinal Pigment Epithelial Cells Induced by Amyloid-β Is Depressed by an Endoplasmic Reticulum Stress Inhibitor

Matsui, Asako 松井, 朝子 名古屋大学

2020.02.03

概要

【緒言】
加齢性黄斑変性症（AMD）は先進国の中途失明の原因として非常に重要な疾患である。AMD の前駆病変であるドルーゼンは、網膜色素上皮細胞（RPE）の下に蓄積する沈着物であり、細胞老化に関連する様々な物質が含まれていると報告されている。アルツハイマー病の病因として知られるアミロイドβ（Aβ）もドルーゼンに含まれていると報告されている。Aβは細胞実験で RPE における血管内皮増殖因子（VEGF）の発現を増加させることが実証されている。

小胞体（ER）は、細胞内の異常な構造を持つタンパク質を除去する役割をもつが、異常なタンパク質が増加するとその細胞は ER ストレス下にあるとされ、小胞体ストレス応答（UPR）と呼ばれる反応が活性化される。UPR も RPE における VEGF の発現を増加させることが報告されている。

今回我々は、ER ストレスを低減することが知られている 4-フェニルブチル酢酸（PBA）が、Aβによる RPE での VEGF の発現増加を抑制することができるかを調べた。

【方法】
細胞実験
RPE の細胞株である ARPE-19 細胞を培養し、コンフルエントに達した後、培地を 1,10 または 25μM Aβを含む無血清培地に切り替え、24 時間培養した。そこへ、 ARPE-19 細胞における Aβ刺激に対する PBA の防御的役割を調べるため、2.5 mMの PBA を添加して 14 時間培養する群を作り、その後、それらの培地を 2.5 mM PBAおよび 25μM Aβを含む培地へ変更し、さらに 24 時間培養した。

また今回の研究では、生体環境により近い状態を模した極性培養も行った。ARPE- 19 細胞をトランスウェルフィルター上（0.4μm 孔）のプレコートマトリゲル上で培養し、こちらも通常の培養と同様に、PBA（2.5 mM）による前処理を 14 時間行った後、Aβ（25μM）および/または PBA（2.5 mM）を ARPE-19 の上側の培地に添加し 24 時間培養した。

酵素免疫測定法
培地中の VEGF 濃度を Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)法を用いて測定した。眼内でドルーゼンが存在するのは RPE の基底側であるため、極性培養実験では RPE の基底膜側の培地中の VEGF 濃度を測定した。

免疫染色
ARPE-19 細胞を培養し、Aβ・PBA 負荷後、ER ストレスのマーカーとして知られる GRP78/Bip の発現を確認する目的で抗 GRP78 抗体を用いて免疫染色した。ER ストレス誘導物質として知られる Tunicamycin も陽性対照として使用して免疫染色を行い、共焦点顕微鏡で観察した。

ウェスタンブロット法
培養したウェルから細胞を回収して煮沸し、遠心分離した後に得られた上清 20μlを使用し、ウェスタンブロット法にて caspase12、caspase4、GADD153 / CHOP と、対照として GAPDH を検出した。再現性を確認するため、3 回行った。

TUNEL 染色
細胞を 2.5mM の PBA または通常の培地で 14 時間前処理した後、2.5mM PBA 添加、25μM Aβ添加、25μM Aβおよび 2.5 mM PBA を添加し 24 時間した。細胞固定後 In Situ Cell Death kit(Roche)を用いて 1 時間染色し、蛍光顕微鏡にて TUNEL陽性細胞の数を計算した。ウェル毎に 3 か所で TUNEL 陽性細胞を計測し、その平均数を算出した。

【結果】
VEGF 濃度
通常の培養で VEGF 濃度を測定すると、対照群では 1,257 pg/ml であり、1、10、 25μM Aβを加えると、それぞれ 1340、1755、2345 pg/ml と増加した。一方、25 μM Aβ＋2.5 mM PBA 群では、741 pg/ml で、25μM Aβ（PBA なし）群よりも有意に低下していた。

極性培養細胞では、基底膜側の培地中 VEGF 濃度は、対照群で 612 pg/ml であったのに対し、25μM Aβ群では 906 pg/ml であったが、2.5mM PBA＋25μM Aβ群では 559 pg / ml と大幅に減少した。

免疫染色
次に、GRP78/Bip について免疫染色を行うと、25μM Aβ群は対照群と比較し蛍光強度が有意に増加していた。しかし、25μM Aβ+ 2.5 mM PBA 群では、25μM Aβ群と比較し、蛍光強度は有意に減少した。

ウェスタンブロット法
ER スト レスマ ー カーで あ る、 cleaved caspase4 、 cleaved caspase12 、GADD153/CHOP は、10μM および 25μM Aβ群で増加がみられた。25μM Aβ＋2.5 mM PBA 群では、cleaved casapse12、4 の発現は低下した。また GADD153 / CHOP も Aβの添加により増加し、PBA の添加によって減少した。

TUNEL 染色
PBA の将来的な利用を踏まえて、Aβと PBA の細胞毒性を確認するために TUNEL 染色を行い陽性細胞（アポトーシス）の数を計測した。

コントロール群、2.5mM PBA 群に比べると、25μ M Aβ群では、それぞれ TUNEL 陽性細胞の数は 3.86 倍、3.37 倍に増加しており、Aβによる細胞毒性が示唆された。また、有意差はないものの、25μM Aβ＋2.5 mM PBA 群では、25μM Aβ群に比べ、TUNEL 陽性細胞の数は減少していた。これらの結果から、PBA は A βによって誘導されるアポトーシスを阻害すること、PBA 自体は強い RPE 毒性を有しないことが示唆され、さらに PBA によってアポトーシスが誘発されたために、 VEGF 濃度が減少したのではないと考えられた。

【考察】
ARPE-19 細胞が Aβに曝露されると、GRP78/Bip の発現は増加し、caspase4、12は活性化された。しかし、それらの発現は、PBA への同時曝露によって減少した。通常の培養と極性培養の両方で、Aβによって VEGF の発現は増加したが、PBA によって抑制された。また、PBA は RPE のアポトーシスを惹起しなかった。

PBA のみの添加では RPE のアポトーシスは増加しなかったため、VEGF 発現の減少は PBA の毒性によるものではなかったと言える。

GRP78/Bip を含む UPR マーカーのシグナルは、Aβ曝露後に著明に増強し、PBA添加後は減弱していた。これらの結果から、Aβに起因する小胞体ストレスが RPE における VEGF の発現を増加させたと考えられた。

CHOP、cleaved caspase12、4 は、ER ストレスによるアポトーシスと炎症に関与することが知られているが、今回、その発現が Aβに反応して増加し、PBA の添加によって抑制された。

PBA による ARPE-19 細胞のアポトーシスの有意な増加は見られず、PBA の細胞毒性のために PBA 添加群で VEGF が減少したということは無いようであった。

25μM Aβ単独曝露群と、25μMAβ+2.5 mM PBA 曝露群では TUNEL 陽性細胞の数に有意差は無かったものの、我々の結果からは、PBA が、アポトーシスを増加させることはなく、Aβに起因するアポトーシスを阻害した、ということが示唆された。

本研究の結果とこれまでの研究から、ER ストレス阻害剤である PBA は、RPE において ER ストレスによる VEGF の発現を抑えることで、AMD の発症を阻害することができると考えてもよいだろう。

【結論】
培養 ARPE-19 への PBA の添加で、Aβに起因する VEGF の発現、ER ストレスマーカーの発現は抑制された。このことから、ER ストレスを標的とする薬剤が、AMD の予防に有効であることが示唆された。

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参考文献

1 Bressler SB, Maguire MG, Bressler NM, Fine SL: Relationship of drusen and abnormalities of the retinal pigment epithelium to the prog- nosis of neovascular macular degeneration. Arch Ophthalmol 1990;108:1442–1447.

2 Anderson DH, Talaga KC, Rivest AJ, Barron E, Hageman GS, Johnson LV: Characteriza- tion of β amyloid assemblies in drusen: the deposits associated with aging and age-related macular degeneration. Exp Eye Res 2004;78: 243–256.

3 Dentchev T, Milam AH, Lee VM, Trojanow- ski JQ, Dunaief JL: Amyloid-β is found in dru- sen from some age-related macular degenera- tion retinas, but not in drusen from normal retinas. Mol Vis 2003;9:184–190.

4 Johnson LV, Leitner WP, Rivest AJ, Staples MK, Radeke MJ, Anderson DH: The Alz- heimer’s Aβ-peptide is deposited at sites of complement activation in pathologic deposits associated with aging and age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:11830–11835.

5 Yoshida T, Ohno-Matsui K, Ichinose S, Sato T, Iwata N, Saido TC, Hisatomi T, Mochizuki M, Morita I: The potential role of amyloid β in the pathogenesis of age-related macular de- generation. J Clin Invest 2005;115:2793.

6 Schröder M, Kaufman RJ: The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Bio- chem 2005;74:739–789.

7 Abcouwer SF, Marjon PL, Loper RK, Vander Jagt DL: Response of VEGF expression to amino acid deprivation and inducers of endo- plasmic reticulum stress. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002;43:2791–2798.

8 Roybal CN, Yang S, Sun C-W, Hurtado D, Vander Jagt DL, Townes TM, Abcouwer SF: Homocysteine increases the expression of vascular endothelial growth factor by a mech- anism involving endoplasmic reticulum stress and transcription factor ATF4. J Biol Chem 2004;279:14844–14852.

9 Hoozemans J, Veerhuis R, Van Haastert E, Rozemuller J, Baas F, Eikelenboom P, Scheper W: The unfolded protein response is activated in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathol 2005;110:165–172.

10 Katayama T, Imaizumi K, Manabe T, Hitomi J, Kudo T, Tohyama M: Induction of neuro- nal death by ER stress in Alzheimer’s disease. J Chem Neuroanat 2004;28:67–78.

11 Ron D, Walter P: Signal integration in the en- doplasmic reticulum unfolded protein re- sponse. Nat Rev Mol Cell Biol 2007;8:519– 529.

12 Bian ZM, Elner SG, Elner VM: Regulated ex- pression of caspase-12 gene in human retinal pigment epithelial cells suggests its immuno- modulating role. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008;49:5593–5601.

13 Bian ZM, Elner SG, Elner VM: Dual involve- ment of caspase-4 in inflammatory and ER stress-induced apoptotic responses in human retinal pigment epithelial cells. Invest Oph- thalmol Vis Sci 2009;50:6006–6014.

14 Hitomi J, Katayama T, Eguchi Y, Kudo T, Taniguchi M, Koyama Y, Manabe T, Yamagi- shi S, Bando Y, Imaizumi K: Involvement of caspase-4 in endoplasmic reticulum stress- induced apoptosis and Aβ-induced cell death. J Cell Biol 2004;165:347–356.

15 Nakagawa T, Zhu H, Morishima N, Li E, Xu J, Yankner BA, Yuan J: Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-β. Nature 2000; 403:98–103.

16 Salminen A, Kauppinen A, Suuronen T, Kaarniranta K, Ojala J: ER stress in Alzhei- mer’s disease: a novel neuronal trigger for in- flammation and Alzheimer’s pathology. J Neuroinflammation 2009;6:41.

17 Oyadomari S, Mori M: Roles of CHOP/ GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ 2004;11:381–389.

18 Collins AF, Pearson H, Giardina P, Mc- Donagh K, Brusilow S, Dover G: Oral sodium phenylbutyrate therapy in homozygous beta thalassemia: a clinical trial. Blood 1995;85: 43–49.

19 Dover GJ, Brusilow S, Samid D: Increased fe- tal hemoglobin in patients receiving sodium 4-phenylbutyrate. N Engl J Med 1992;327: 569–570.

20 Kubota K, Niinuma Y, Kaneko M, Okuma Y, Sugai M, Omura T, Uesugi M, Uehara T, Ho- soi T, Nomura Y: Suppressive effects of 4- phenylbutyrate on the aggregation of Pael re- ceptors and endoplasmic reticulum stress. J Neurochem 2006;97:1259–1268.

21 Maestri NE, Brusilow SW, Clissold DB, Bas- sett SS: Long-term treatment of girls with or- nithine transcarbamylase deficiency. N Engl J Med 1996;335:855–860.

22 Oh S, Hong HS, Hwang E, Sim HJ, Lee W, Shin SJ, Mook-Jung I: Amyloid peptide atten- uates the proteasome activity in neuronal cells. Mech Ageing Dev 2005;126:1292–1299.

23 Özcan U, Yilmaz E, Özcan L, Furuhashi M, Vaillancourt E, Smith RO, Görgün CZ, Hota- misligil GS: Chemical chaperones reduce ER stress and restore glucose homeostasis in a mouse model of type 2 diabetes. Science 2006; 313:1137–1140.

24 Qi X, Hosoi T, Okuma Y, Kaneko M, Nomura Y: Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol 2004;66:899–908.

25 Sonoda S, Spee C, Barron E, Ryan SJ, Kannan R, Hinton DR: A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human ret- inal pigment epithelial cells. Nat Protoc 2009; 4:662–673.

26 Dunn KC, Aotaki-Keen AE, Putkey FR, Hjelmeland LM: Arpe-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Exp Eye Res 1996;62:155–169.

27 Maminishkis A, Chen S, Jalickee S, Banzon T, Shi G, Wang FE, Ehalt T, Hammer JA, Miller SS: Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit mor- phology and physiology of native tissue. In- vest Ophthalmol Vis Sci 2006;47:3612–3624.

28 Kaneko H, Ye F, Ijima R, Kachi S, Kato S, Nagaya M, Higuchi A, Terasaki H: Histamine receptor H4 as a new therapeutic target for choroidal neovascularization in age-related macular degeneration. Br J Pharmacol 2014; 171:3754–3763.

29 Ye F, Kaneko H, Nagasaka Y, Ijima R, Naka- mura K, Nagaya M, Takayama K, Kajiyama H, Senga T, Tanaka H: Plasma-activated medi- um suppresses choroidal neovascularization in mice: a new therapeutic concept for age- related macular degeneration. Sci Rep 2015;5: 7.

30 Fujii Y, Kachi S, Ito A, Kawasumi T, Honda H, Terasaki H: Transfer of gene to human ret- inal pigment epithelial cells using magnetite cationic liposomes. Br J Ophthalmol 2010;94: 1074–1077.

31 Koyama Y, Matsuzaki S, Gomi F, Yamada K, Katayama T, Sato K, Kumada T, Fukuda A, Matsuda S, Tano Y: Induction of amyloid β accumulation by ER calcium disruption and resultant upregulation of angiogenic factors in ARPE19 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008;49:2376–2383.

32 Doh SH, Kim JH, Lee KM, Park HY, Park CK: Retinal ganglion cell death induced by endo- plasmic reticulum stress in a chronic glauco- ma model. Brain Res 2010;1308:158–166.

33 Li J, Wang JJ, Yu Q, Wang M, Zhang SX: En- doplasmic reticulum stress is implicated in retinal inflammation and diabetic retinopa- thy. FEBS Lett 2009;583:1521–1527.

34 Gorbatyuk MS, Knox T, laVailmm, Gor- batyuk OS, Noorwez SM, Hauswirth WW, Lin JH, Muzyczka N, Lewin AS: Restoration of visual function in P23H rhodopsin trans- genic rats by gene delivery of BiP/Grp78. Proc Natl Acad Sci 2010;107:5961–5966.

35 Libby RT, Gould DB: Endoplasmic reticulum stress as a primary pathogenic mechanism leading to age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol 2010;664:403–409.

36 Ijima R, Kaneko H, Ye F, Nagasaka Y, Takaya- ma K, Kataoka K, Kachi S, Iwase T, Terasaki H: Interleukin-18 induces retinal pigment ep- ithelium degeneration in mice. Invest Oph- thalmol Vis Sci 2014;55:6673–6678.

37 Lee KS, Lee HJ, Kim DH, Noh YH, Yu K, Jung HY, Lee SH, Lee JY, Youn YC, Jeong Y: Acti- vation of perk signaling attenuates Aβ- mediated ER stress. PloS One 2010;5:e10489.

38 Rao R, Ellerby H, Bredesen D: Coupling en- doplasmic reticulum stress to the cell death program. Cell Death Differ 2004;11:372–380.

39 Brown DM, Kaiser PK, Michels M, Soubrane G, Heier JS, Kim RY, Sy JP, Schneider S: Ra- nibizumab versus verteporfin for neovascular age-related macular degeneration. N Engl J Med 2006;355:1432–1444.

40 Rosenfeld PJ, Brown DM, Heier JS, Boyer DS, Kaiser PK, Chung CY, Kim RY: Ranibizumab for neovascular age-related macular degen- eration. N Engl J Med 2006;355:1419–1431.

41 Ijima R, Kaneko H, Ye F, Takayama K, Naga- saka Y, Kataoka K, Funahashi Y, Iwase T, Ka- chi S, Kato S: Suppression of laser-induced choroidal neovascularization by the oral med- icine targeting histamine receptor H4 in mice. Transl Vis Sci Technol 2015;4:6.

42 Mullins RF, Russell SR, Anderson DH, Hag- man GS: Drusen associated with aging and age-related macular degeneration contain proteins common to extracellular deposits as- sociated with atherosclerosis, elastosis, amy- loidosis, and dense deposit disease. FASEB J 2000;14:835–846.

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