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A Rapid ATP Bioluminescence-based Test for Detecting Levofloxacin Resistance Starting from Positive Blood Culture Bottles

松井 篤 富山大学

2020.03.24

概要

〔目的〕
血液培養検体の薬剤感受性試験は、陽性後検体に含まれる細菌を平板培地で分離培養を行い、それで得られた分離株に対して行うのが一般的であるが、薬剤感受性試験迅速化のため近年では血液培養検体を直接用いた手法が開発されている。細菌増殖の検出には、濁度測定や顕微鏡的にコロニー形成を確認する手法が採用されている。一方で、アデノシン三リン酸（ ATP）は全ての生物に共通のエネルギー分子であり、生菌内ATP量を経時的に測定することで濁度やコロニー形成による判定よりも更に鋭敏に細菌増殖を 検出することが可能ではないかと考えた。ATP生物発光に基づく薬剤感受性試験そのものは、既に尿検体や単離株には応用されているが血液培養標本は今までの研究では対象となっていない。これは検体中の血球に含まれる細胞内ATP（ background ATP） が生菌由来のATP量に比して厖大であり、感受性試験への影響が無視できないことによる。本研究では、この問題を解決し、ATP生物発光を基にした血液培養検体を直接用いる、抗菌薬感受性を検出するための鋭敏かつ迅速な方法を開発することである。

〔方法並びに成績〕
ATP生物発光に基づく迅速な方法は、4つの工程で構成される。①血液培養検体に含まれる血球成分を血清分離採血管で遠心分離（2000G, 10分間）することで除去する, ②得られた上清と分離剤上のペレットとなった細菌を均一化して培養液で30000倍に希釈し、遊離ATP除去目的にATP消去試薬を添加する, ③抗菌薬とともに培養させ、一定時間ごとにサンプル採取を行って生菌内 ATPをATP抽出試薬で抽出する, ④抽出された生菌内ATPをATP生物発光で測定し、経時的変化をプロットする。①～②の工程により、健常人血液による疑似陰性検体から得られた最終サンプル溶液10μLあたりのbackground ATPは、10,000,000amolから100～ 400amolへと著明に低下させることが出来た。臨床検体15検体(12菌種)による検討において、本手法で得られたレボフロキサシの発育阻止濃度は15検体中10検体で従来法の値と完全に一致し、特に発育速度の早いグラム陰性桿菌では最速で4時間での判定が可能であった。残りの5検体では従来法よりも高値であり、従来法よりも低値となった検体はなかった。また、追加検討で行った分離株による擬似陽性検体においても同様の傾向を認めた。これは、ATP生物発光を用いる分子生物学的な検出系は濁度やコロニー形成など物理的な検出系と比べ てより高感度に細菌増殖を検出しうる、という仮説を支持している。また、この微細な変化は上述のbackground ATPの減少なくしては検出不可能であった。

〔総括〕
ATP生物発光を基にした血液培養検体を直接用いる薬剤感受性試験を開発し、従来法と比して鋭敏かつ迅速（最速4時間） な抗菌薬感受性判定を可能とした。今後は種々の抗菌薬で大規模検討を行い、実用化を目指す計画である。

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