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大学・研究所にある論文を検索できる 「Chondroitin-4-sulfate transferase-1 depletion inhibits formation of a proteoglycan-rich layer and alters immunotolerance of bone marrow mesenchymal stem cells on titanium oxide surfaces」の論文概要。リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。
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Chondroitin-4-sulfate transferase-1 depletion inhibits formation of a proteoglycan-rich layer and alters immunotolerance of bone marrow mesenchymal stem cells on titanium oxide surfaces

神尾, 尚伸 名古屋大学

2021.04.19

概要

【緒言】
　チタン製インプラントは優れた生体親和性、力学特性、耐食性を有するため歯科治療などに広く利用されている。オッセオインテグレーションはチタンと骨組織が直接結合した状態であり、インプラント治療が成功するためには必須の現象である。しかし、チタン上における骨形成過程や生体親和性の詳細な分子メカニズムは解明されていない。
　電子顕微鏡でチタンと骨組織の界面にルテニウムレッド陽性を示すプロテオグリカン層が観察される。プロテオグリカンはタンパク質とグリコサミノグリカンの複合体であり、グリコサミノグリカン鎖の末端に存在するグリコサミノグリカンの中でChondroitin-4-sulfate(C4S)のみがチタンに直接結合することが報告されている。C4Sは糖転移酵素であるChondroitin4-O-sulfotransferase(C4ST)ファミリー（C4ST-1,-2,-3）によりタンパク質に付加されるが、その中でC4ST-1は骨格の成長、シグナル伝達および、癌を含むヒトの疾患においても役割を果たすことが示唆されている。
　本研究では、C4ST-1がチタン上におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞（BMSCs）のプロテオグリカン層の形成や骨形成能、免疫寛容能に与える影響を解析することを目的とした。

【材料・方法】
　ヒトBMSCs株UE7T-13にリポフェクション法でC4ST-1のshRNAを導入しピューロマイシンによる薬剤選択後、限界希釈法によってshRNA安定発現株のシングルクローンを作製した（sh-BMSCs群）。同様にしてsh none targetを導入した細胞を作製し（N-BMSCs群）、リアルタイムPCR法およびウェスタンブロッティングによってC4ST-1の発現を解析した。それぞれの細胞の特性を分化誘導（骨、脂肪、軟骨）およびフローサイトメトリーで解析後、これらの細胞をチタン板上に播種し、透過型電子顕微鏡でチタンと細胞の界面を観察した。また、骨形成能をリアルタイムPCR法およびアリザリンレッド染色で、細胞増殖能をWST-8キットで、初期接着能を免疫組織化学染色で、免疫寛容能をリアルタイムPCR法で解析した。それぞれの実験に際してチタン板をフッ化水素酸および硝酸を用いて酸洗し、その表面形態および元素組成を走査型電子顕微鏡（SEM-EDX）により解析した。

【結果】
チタン板表面の形態および元素解析
　酸洗後のチタンは機械研磨により生じる凹凸や有機物の付着はなく、またアルミニウムやバナジウムが混合されていない純チタンであった。
N-BMSCsおよびsh-BMSCsの特性
　N-BMSCsおよびsh-BMSCsは骨、脂肪、軟骨分化能を有した。またフローサイトメトリーによる解析ではいずれの細胞群も幹細胞マーカー（陽性：CD73、CD90、CD105、陰性：CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR）が維持されていた。
N-BMSCsおよびsh-BMSCsのC4STファミリーの遺伝子発現
　チタン上で7および14日間培養したsh-BMSCsは、N-BMSCsと比較してC4ST-1の発現が有意に低下しており、C4ST-2,-3の発現に有意差はなかった（Fig.1）。
細胞とチタン界面のプロテオグリカン層の観察
　培養14日間でチタンと細胞の界面にルテニウムレッド陽性像が観察された。チタン上で培養したsh-BMSCsはN-BMSCsと比較してプロテオグリカン層の面積が有意に減少し、相対輝度（プロテオグリカン層／細胞質）が有意に低下した（Fig.2）。
初期接着能および細胞増殖能の測定
　チタン上で1および3時間培養したN-BMSCsとsh-BMSCsにおけるvinculinの発現に差はなかった。また、面積、近似楕円長軸、最大径に有意差はなかった。24、48、72時間培養したN-BMSCsとsh-BMSCsの細胞増殖能に有意差はなかった（Fig.3）。
骨形成能および石灰化能の解析
　チタン上で7および14日間培養したN-BMSCsとsh-BMSCsの骨関連遺伝子発現に有意差があったが、その差は10-30%であった。また、アリザリンレッド染色では有意差はなかった（Fig.4）。
免疫寛容能
　チタン上で14日間培養したsh-BMSCsは、N-BMSCsと比較してIL-6およびIDOの発現が有意に高かった。また、sh-BMSCs由来培養上清は、N-BMSCs由来培養上清と比較してヒトマクロファージにおけるIL-6、CD80、IDOの遺伝子発現を有意に亢進させた（Fig.5,6）。

【考察】
　本研究ではチタン上のBMSCsに対してC4ST-1がプロテオグリカン層の形成、骨形成能および免疫寛容能に与える影響を解析した。透過型電子顕微鏡の結果からチタンと細胞界面にはN-BMSCs、sh-BMSCsともに20-500nm程度のプロテオグリカン層が観察され、その厚さは過去の報告と同等であり、チタン上のBMSCsにおけるC4ST-1はプロテオグリカン層の形成量に関与するが、厚さには影響を与えないことが示唆された。また、細胞増殖能、細胞接着能、骨形成能、石灰化能の解析結果から、酸化チタン上のBMSCsにおけるC4ST-1は細胞増殖、接着、骨分化能に影響を与えないことが示唆された。C4SはBMSCsの骨分化を促進しないと報告されていることから、プロテオグリカン層は酸化チタン上のBMSCsの細胞増殖能や骨形成能には影響を与えないことが示唆された。本研究ではC4ST-1の発現低下によりBMSCsの免疫寛容能に影響を与え、マクロファージの極性はM1になった。これらのことからプロテオグリカン層は酸化チタン上のBMSCsの免疫寛容能においてM2様マクロファージを誘導する因子の分泌に影響を与える可能性が示唆された。
酸化チタンの表面改変がBMSCsの分化能に影響を与えることが報告されている。
　今後、異なる表面性状および形状の酸化チタン上でBMSCsにおけるC4ST-1の影響を解析し、臨床研究の結果と関連付けて解析する必要があると考えられた。

【結論】
　本研究により、BMSCsにおけるC4ST-1は酸化チタン上のプロテオグリカン層の形成に影響を与えるが、細胞増殖能や骨分化能には影響しないことが示唆された。また、プロテオグリカン層はBMSCsの免疫寛容能を直接的および間接的に変化させる可能性が示唆された。

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