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ラット歯髄細胞による石灰化への糖化最終産物（AGEs）の影響

杉山, 敬多 大阪大学 DOI:10.18910/82174

2021.03.24

概要

【研究の目的】
慢性糖尿病患者の歯髄内には石灰化物が高頻度に認められる。この現象は高血糖状態の継続によって形成される糖化最終産物(AGEs)が関与していると考えられているが、明確な機序は不明である。本研究ではAGEsによる新た石灰化物誘導メカニズムを見出すことを目的とし、糖尿病下の歯髄を想定した石灰化誘導環境として新たに糖化コラーゲンディッシュを開発した上で、以下の検討を行った。

【研究の方法】
実験1.細胞培養実験
AGEsを含む糖化コラーゲン上での培養環境の構築のため豚腱由来のペプシン可溶化Typelコラーゲンをディッシュ内面にコート後、DL-glyceraldehydeにより糖化処理を行い、糖化コラーゲンディッシュを作製した。歯髄細胞は6週齢雄性SDラットの切歯より歯髄細胞を採取し3回の継代したものを用いた。さらに石灰化を誘導増殖培地にAscorbic acid、β -Glycerophosphateを加えた石灰化誘導培地を用い、3日おきに交換し培地を維持し以下 1.1から1.8の実験を行った。

1.1細胞増殖試験、1.2細胞毒性試験
24時間後の細胞増殖をWST-1 assayを用いて測定した。また石灰化誘導後15日目までの培養上清中の乳酸脱水素酵素(LDH)を測定し細胞障害をモニタリングした。

1.3 ALP (Alkaline phosphatase)染色、1.4 Alizarin Red S 染色
石灰化誘導後7日目、14日目にALP染色、7日目、14日目、21日目にAlizarin Red S染色を行い歯髄細胞の分化度と石灰化を評価した。

1.5透過型電子顕微鏡(TEM)による観察、制限視野電子線回折(SHAD)解析
石灰化誘導後の細胞について超薄切片を作製し、TEMによる微細構造の観察およびSHAD解析を行い、石灰化物の結晶構造を評価した。

1.6走査型電子顕微鏡(SEM)による観察、エネルギー分散型X線(EDX)分析
石灰化誘導後の細胞についてtブチルアルコール凍結真空乾燥法にて試料を作製した。SEMによる微細構造の観察およびEDX分析を行い石灰化物の元素組成を測定した。

1.7リアルタイムRT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)法による遺伝子発現の解析
石灰化誘導後7 日目、石灰化関連マーカ ー(Osteopontin[OPN]、Osteocalcin [OCN]、Dentin matrix protein- 1[DMP-1]、Dentin sialophosphoprotein [DSPP])についてリアルタイムRT-PCR法による遺伝子発現解析を行った。

1.8免疫組織化学染色による組織学的評価
石灰化誘導後7日目の細胞から薄切切片を作製し、免疫組織化学染色(抗0PN抗体、抗0CN抗体、抗DMP-1抗体、抗DSPP抗体、3, 3’-diaminobenzidine[DAB]発色)により組織学評価を行った。

実験2.無細胞下での結晶析出実験
実験1と同様の方法で作製した糖化コラーゲンディッシュをリン酸カルシウム溶液に25°Cで12時間浸漬し結晶を析出させた。細胞培養実験と同様にTEMによる観察とSHAD解析およびSEMによる観察とEDX分析を行った。

実験3. in vivoにおける石灰化物形成の評価
実験1と同様の糖化条件で作製した糖化ゼラチンスポンジを用いて、8週齢の雄SDラットの臼歯部へ直接覆髄実験を行った。直接覆髄の4週間後にマイクロComputed Tomography (マイクロCT)によるデンテインブリッジの形成の評価、および同試料を樹脂包埋後、研磨切片を作製しSEMによる観察を行った。

統計解析
結果は糖化コラーゲンコート、コラーゲンコート、非コートの3つの群に関して細胞増殖試験、細胞毒性試 験、ALP染色およびAlizarin Red S染色についてはOne-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey5 s testを用いて解析した。リアルタイム 定量RT-PCRについてはOne-way repeated measures analysis of variance (ANOVA) with Tukey’ s testを用いて解析した。細胞培養実験の系および結晶析出実験の系はそれぞれ独立した実験系として4回行い、実験系に含まれる各々の解析(実験1.1から1.8および実験2)は3回ずつ繰り返した。全ての解析において、データは平均値土標準偏差(SD, η = 3)で表し、ρ値が0.05未満である場合に統計的に有意な差があると判定した。

【結果】
1.1,2 糖化コラーゲンは24時間後の細胞増殖に関して影響を与えなかった。・方で6日目以降から上清中のLDH量は増加し、糖化コラーゲンは6日目以降から細胞障害に有意な影響を与えた。

1.3,4 14日目までのALPの染色性は一様に増加したが差は認められなかった。一方で14目目、21日目のAlizarin Red Sの染色性に有意な差が認められた。

1.5 石灰化誘導後14日目、21日目の試料に関して糖化コラーゲン上の歯髄細胞周囲に高電子密度領域が観察された。同部位の電子線回折解析はring patternを呈し、ハイドロキシアパタイトに一致する結晶構造が確認された。

1.6 石灰化誘導後14日目、21日目の試料に関して糖化コラーゲン上の歯髄細胞周囲に顆粒状の高信号領域が認められた。同部位の元素組成解析によりリンとカルシウムが検出された。

1.7 糖化コラーゲンは石灰化関連マーカーの遺伝子発現に有意な影響を与えなかった。

1.8 石灰化関連マーカー関して細胞質と細胞外マトリックスに抗原陽性部位を認め、染色性に顕著な差は認められなかった。

2. TEM観察では糖化コラーゲン線維上に大きな高電子密度領域が観察された。SHAD解析においてはdot patternを呈し、高純度の結晶の析出が確認された。SEM観察では糖化により架橋された高密度の糖化コラーゲン線維間に顆粒状に電子密度の高い領域が多く確認された。同部位のEDX分析によりカルシウムやリンなどのアパタイトの主成分が検出された。

3. 糖化ゼラチンスポンジにより直接覆髄を行ったラット歯髄において、マイクロ CTによる評価ではコントロールに比べてデンテインブリッジが欠損なくつながった完全形成の割合が多かった。一方でコントロールの試料は形成なしの割合が多く、一部不完全形成も認められた。SEM観察においては覆髄面に象牙質と連続性をもっているが細管構造は認められない不定形の石灰化物が確認された。また石灰化物周囲の構成細胞や細胞外基質に炎症所見は認められなかった。

【考察】
本研究において新たに開発された糖化コラーゲンディッシュはAGEsが固相状態で存在し、培養環境において安定した状態で維持されることからAGEsを含む糖化コラーゲンの培養歯髄細胞への影響を正確に評価できる。糖化コラーゲン上での歯髄細胞の石灰化誘導実験ではAGEsは細胞の分化、増殖および石灰化マーカーの発現に影響を与えない一方で石灰化物の形成を促進することが明らかとなった。これには、AGEsへの石灰沈着と細胞障害による異栄養性石灰化が大きく影響している。このメカニズムとしてAGEの形成過程において正の電荷をもったアミノ酸が失われ局所的に負の極性が生じることによってAGEs周囲にカルシウムイオンの集積が生じ、細胞周囲におけるカルシウムイオンの集積が細胞内イオン濃度の急激な上昇を招き、恒常性が破綻することが細胞障害および異栄養性石灰化を引き起こしたと考えられる。今後、このメカニズムを応用し糖化コラーゲンを有効に用いることで、生体において効果的な硬組織形成を誘導する覆髄材等の医療応用が可能になることが期待される。

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