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γ-グルタミルトランスペプチダーゼ活性を検出する蛍光プローブを用いた肝癌術中診断法の開発

宮田, 陽一 東京大学 DOI:10.15083/0002004467

2022.06.22

概要

背景
　癌に対する外科治療において、蛍光発光物質を用いた癌の同定法が開発され、実臨床で応用されている。特に肝臓外科領域では、indocyanine green(ICG)を用いた近赤外蛍光イメージング技術が開発され、臨床応用されつつあるが、偽陽性率は40%程度と比較的高く、新たな癌特異的蛍光プローブの開発が求められていた。
　2011年にUranoらは様々な癌種の細胞表面に高発現している、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-Glutamyltranspeptidase, GGT)に着目し、GGTを標的とした新規蛍光プローブ（γ-glutamyl hydroxymethyl rhodamine green[gGlu-HMRG])を開発し、これまでにさまざまな領域の癌種でgGlu-HMRGによる蛍光イメージングの有用性が示されてきた。GGTは肝細胞癌や肝内胆管癌の細胞膜にも高発現しているという報告があり、肝胆膵領域でもgGlu-HMRGを用いた蛍光イメージングが可能性であると考えられた。
　本研究の目的は、GGTを標的とした蛍光プローブであるgGlu-HMRGを癌切除標本に散布することにより、原発性肝癌(肝細胞癌および肝内胆管癌)および大腸癌肝転移を迅速に同定する技術を開発することである。また、癌組織の蛍光強度を測定しGGT活性を評価することで、癌の生物学的特性や予後が推定に応用できないかを検討した。

方法
　2010年7月から2014年2月までの原発性肝癌と大腸癌肝転移に対する肝切除症例を対象とした。標本摘出後、癌部および非癌部が同時に含まれるようにsampleを採取した。また大腸癌肝転移症例において、大腸癌と同時切除した症例では、原発巣の大腸癌も同様に、癌部、非癌部が同時に含まれるように切り出しsampleを採取した。
　gGlu-HMRG、ICGによる蛍光イメージングはMaestro In Vivo Fluorescence Imaging Systemを用いて行った。一部の症例ではGGT活性阻害剤(GGT inhibitor)であるGGsTopを併用して蛍光イメージングを行い、gGlu-HMRg投与における蛍光発光がGGTとの特異的反応であることを確認した。ICG蛍光イメージングでは蛍光発光パターンを、”cancerous-type”(癌部が蛍光発光しているもの)と”rim-type”(癌部自体は蛍光発光しておらず、周囲の非癌部がリング状に蛍光発光しているもの)の2つに分けて評価した。蛍光イメージングと同時に各sampleの癌部、非癌部それぞれの蛍光強度(Fluorescence intensity, FI値)の測定も行った。
　蛍光イメージングと癌の生物学的特性との関係を調べるために、GGTのアイソザイムであるGGT1とGGT6の2種類の抗体を用いて、GGT免疫染色を行った。免疫染色の評価は癌部、非癌部の細胞表面の染色の程度により、癌部の方が非癌部より低いもの(Grade 1)、同等のもの(Grade 2)、高いもの(Grade 3)の三段階に分けて行った。また肝内胆管癌、大腸癌肝転移の症例では、癌部の染色されている領域の、癌部全体に占める割合を、染色率として評価した。

結果
　本研究期間中の対象症例は95症例であり、肝細胞癌が48症例、腺癌症例(肝内胆管癌8症例、大腸癌肝転移39症例)が47症例であった。血清GGT値は肝細胞癌症例と腺癌症例とで有意差はなく(48[16-593] vs. 46[13-646], P=0.592)、疾患別では肝細胞癌症例で最も高く、肝内胆管癌症例(37[15-646])が最も低かった。
　gGlu-HMRGによる蛍光イメージングは、95症例に対する肝切除で得られた103の肝腫瘍(肝細胞癌50結節、肝内胆管癌8結節、大腸癌肝転移45結節)と、大腸癌同時性肝転移症例9例から得られた、10切片の大腸癌原発巣標本に対して行った。肝細胞癌症例では30結節(60%)で、腺癌症例ではすべての結節で肉眼的蛍光発光を認めた。。肝細胞癌症例に関して、ROC曲線から算出されたFI値のcutoff値は5.7(arbitrary units, A.U.)であり、FI値の高い、High-gGlu-HMRGHCC群は24結節(48%)であり、腫瘍検出の感度/特異度は48%/96%であった。GGT inhibitorを混合したプローブ溶液では肝細胞癌、肝内胆管癌、大腸癌肝転移のすべての症例で肉眼的な蛍光発光は認識できず、またすべての症例の癌部と非癌部のFI値は、gGlu-HMRG単剤のプローブに比べて低かった。
　ICG蛍光イメージングは肝細胞癌症例41結節、肝内胆管癌症例7結節、大腸癌肝転移症例38結節に対して行った。肝細胞癌症例で、cancerous-typeの蛍光発光を呈したもの(cancerous-type HCC)は25結節(61%)であり、残りの16結節(39%)ではrim-typeの蛍光発光を呈していた(rim-type HCC)。一方、肝内胆管癌症例と大腸癌肝転移症例はすべてrim-typeであった。肝細胞癌症例での腫瘍検出の感度/特異度は59%/78%であった(cutoff値0.20[A.U.])。
　GGT1抗体による免疫染色の染色Gradeの評価では、Low-gGlu-HMRGHCCに比べてHigh-gGlu-HMRGHCCで染色Gradeが高く、癌部は非癌部に比べて強く染色される傾向にあり、Low-gGlu-HMRGHCCでは染色Grade 2, 3であった症例の割合は6症例(35%)であったのに対し、High-gGlu-HMRGHCCでは21症例(91%)であった(P<0.001)。一方肝内胆管癌症例と大腸癌肝転移症例は全例でGrade 3であった。肝内胆管癌症例、大腸癌肝転移症例の染色率の中央値はそれぞれ90%(range5%-90%)、40%(range5%-90%)であった。大腸癌同時性肝転移で原発巣と同時切除した症例において、大腸癌肝転移巣と対応する原発巣の染色率は強い相関関係にあった(r=0.873、P=0.001)。GGT6抗体による免疫染色では肝細胞癌症例、肝内胆管癌症例のすべての症例で染色率は0%であった。一方、大腸癌肝転移症例では染色率の中央値は20%(0%-90%)であった。またGGT1免疫染色と同様に、大腸癌同時性肝転移で原発巣と同時切除した症例において、大腸癌転移巣と対応する原発巣の染色率は強い相関関係にあった(r=0.656、P=0.039)。
　肝細胞癌症例ではHigh-gGlu-HMRGHCC群では、Low-gGlu-HMRGHCC群に比べて、術前のαフェトプロテイン値が有意に高く(24.0[ng/ml] vs. 6.5[ng/ml, P=0.021)、また切除検体の顕微鏡的脈管侵襲の割合が有意に多かった(58% vs. 27%, P=0.025)。大腸癌肝転移症例はgGlu-HMRGのFI値の中央値(11.7[A.U.])により、High-gGlu-HMRGCRLM群(23結節、20症例)とLow-gGlu-HMRGCRLM群(22結節、19症例)に分けて検討した。High-gGlu-HMRGCRLM群ではLow-gGlu-HMRGCRLM群に比べて術前GGT値が有意に高く(64[U/L] vs. 29[U/L], P=0.025)、また術後6ヶ月以内の早期再発の割合が高かった(45% vs. 16%, P=0.048)。High-gGlu-HMRGHCC群とLow-gGlu-HMRGHCC群とでは、無再発生存期間に有意差はなかった(P=0.346)。一方、High-gGlu-HMRGCRLM群はLow-gGlu-HMRGCRLM群に比べて、無再発生存期間は有意に低く、2年無再発生存期間はそれぞれ11%、32%であった(P=0.026)。

結語
　gGlu-HMRGを散布することによる蛍光イメージングは、肝細胞癌、肝内胆管癌、および大腸癌肝転移の癌組織を迅速に、高感度かつ高い特異度で同定することができた。肝癌の切除標本に対しgGlu-HMRGを用いた蛍光イメージングを実施し、蛍光シグナルの強度を計測することで、癌組織の病理学的な特徴や再発リスクを予測できる可能性が示唆された。

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