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蛍光プローブによる大腸腫瘍の迅速イメージングに関する研究

松崎, 裕幸 東京大学 DOI:10.15083/0002004264

2022.06.22

概要

蛍光プローブとは、ある特定の標的分子と反応することでその構造が変化して、強い蛍光を発したり、蛍光の色調が変化したりする機能性分子の総称である。簡便かつ高感度に観測対象分子を可視化する蛍光プローブは、現在の生命科学研究や医学・薬学研究において重要なツールとなっている。例えば、ある癌細胞に特異的に発現している酵素と反応することで、癌細胞のみを選択的に蛍光で識別することができるようになる。

大腸癌は,世界的に癌罹患・死亡数の多くを占めている。大腸内視鏡による大腸ポリープの早期発見と切除により、大腸癌の死亡率が減少すると報告されており、さまざまな特殊光内視鏡などの新技術も開発されてきているが、大腸癌の存在診断のための確立された有効な技法は未だ存在しない。そのような状況の中、蛍光プローブは組織に散布するだけで癌細胞のみを特異的に検出しうる画期的な技術であり、外科手術や内視鏡検査においてもその有用性が期待されている。

Hexosaminidaseはリソソーム酵素の一つであり、実験的にラットの大腸腫瘍において発現レベルが上昇していることが報告されており、ヒトにおいても大腸癌において正常組織よりもhexosaminidase活性が上昇していることが報告されている。このような背景から、hexosaminidaseが大腸癌の蛍光イメージングにおいて有望なターゲットになりうると考えられ、これを標的とした蛍光プローブであるHMRefβGlcNAcを創製した。さらに、HMRef-βGlcNAcを、大腸癌細胞株、マウスモデル、ヒト大腸癌検体に適用し、その有効性の検討を行った。

ヒト大腸腺癌細胞株4種(HCT116,HT29,DLD1,SW480)にHMRef-βGlcNAcを添加して共焦点蛍光顕微鏡で観察を行うと、いずれの細胞においても投与1分後の時点から蛍光が確認され、経時的に蛍光強度の上昇が見られた。さらに4種類の細胞株において定量的リアルタイムPCRを行ったところ、hexosaminidaseのサブユニットであるHEXAおよびHEXBのmRNA発現レベルは、上述の生細胞イメージングの蛍光強度順と概ね一致した。次に、hexosaminidaseの基質特異性を調べるため、HEXAとHEXBに対するsmallinterferingRNA(siRNA)を細胞株に導入して同様に生細胞イメージングで蛍光強度測定を行ったところ、対照のnegativesiRNAと比較して、20-40%の蛍光強度低下が見られた。次にhexosaminidaseのサブユニットであるHEXAとHEXBに対する抗体を用いて、蛍光免疫染色を行ったところ、いずれの細胞株についても細胞質内に点状の蛍光が認められ、知見通りにhexosaminidaseが細胞のリソソーム内に局在していることが確認された。また、HMRef-βGlcNAcの標的分子であるhexosaminidaseは酸性環境下のリソソーム内に存在していることから、細胞ライセートを調整し、異なるpH条件下におけるhexosaminidaseとの反応性を調べたところ、いずれの細胞においても、中性条件(pH7.4)よりの酸性条件(pH5.0)においてより高い反応性を示しており、HMRef-βGlcNAcがリソソームのhexosaminidaseと反応していることと矛盾しない結果であった。これらの結果より、ヒト大腸癌細胞株においてHMRef-βGlcNAcはリソソーム内のhexosaminidaseと反応し、その発現レベルが蛍光強度に反映されていることが確認できた。

生体での癌イメージングにおけるHMRef-βGlcNAcの有用性を検討するため、HCT116細胞株を用いて作成した大腸癌腹膜播種モデルマウスでの実験を行った。HMRef-βGlcNAcによる蛍光イメージングで播種結節は特異的に認識することができ、肉眼では指摘することが困難な1mm未満の腸間膜の微小結節も、HMRef-βGlcNAcにより明瞭に指摘することができた。また、蛍光スペクトル分離により、腹膜結節由来の蛍光スペクトルはHMRefの蛍光スペクトルと一致し、周囲組織の自家蛍光スペクトルとは明らかに異なることも確認できた。さらに、蛍光が見られた播種結節のHE染色を行い、癌組織を呈していることも確認した。

次に、実臨床での応用を視野に入れて、ヒト大腸癌手術検体にHMRef-βGlcNAcを適用して、その反応性を検討することとした。経時的に蛍光強度の上昇が確認でき、肉眼的に高い腫瘍/正常比が得られた。また、抗HEXA抗体を用いた免疫染色により、癌部でHEXA陽性であり、蛍光イメージングの所見と一致することが確認された。

大腸腫瘍検体での蛍光イメージングで得られた画像上でROI(Region of interest)を設定し蛍光強度を数値化して、プローブ適用前と30分後における蛍光強度変化でのROC曲線(Reciever operating curve:受診者動作特性曲線)を作成し、カットオフ値および感度・特異度を算出した。HMRef-βGlcNAcを適用した10症例について、感度80%、特異度90%と良好であり、HMRef-βGlcNAcが大腸癌の蛍光イメージングに有効であることが示唆された。

本研究では、リソソーム酵素であるhexosaminidaseに着目して新しい蛍光プローブHMRefβGlcNAcの創製を行い、細胞実験、マウスモデル、ヒト大腸癌手術検体に適用してその有用性を検討した。症例数は限られているものの、良好な感度・特異度であり、実臨床での応用も期待される結果であった。

大腸癌は世界でも日本でも増加している癌であるが、早期発見と治療によって比較的高い確率で治癒が望める。したがって、内視鏡での早期発見と治療が非常に重要であり、蛍光プローブの臨床応用が期待される領域である。一方、進行大腸癌においても、たとえばリンパ節転移や腹膜播種などの術中イメージングが蛍光プローブによって可能になれば、根治性は損なわずに切除範囲を縮小でき、リンパ節郭清の範囲を縮小でき、機能障害や合併症を減らすことができる可能性もある。今後、手術検体でのさらなる症例集積を進めつつ、より早期の大腸癌や大腸腺腫での有効性の検討も必要と考えられ、ESD(内視鏡的粘膜下層剥離術)など内視鏡的切除検体での検討も進めていきたい。

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