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早産発症におけるapoptosis signal-regulating kinase 1の関与の検討

吉川, 美登利 東京大学 DOI:10.15083/0002005109

2022.06.22

概要

【目的】
　早産は22週から36週6日までに分娩に至る産科合併症であり、新生児の罹病率や死亡率の主な原因となっている。早産・低出生体重児の管理の進歩により早産児の死亡率は低下しているが、高年妊娠の増加や生殖補助医療による多胎妊娠の増加などの理由から、早産率は上昇傾向にある。早産の主な原因は子宮内感染と言われている。腟から上行性に感染が起き、炎症が子宮全体に波及する。炎症の波及によりサイトカインや子宮収縮物質、マトリックスメタロプロテアーゼなどが放出されると、子宮収縮や、子宮頸管・卵膜の脆弱化が惹起され早産に至る。炎症が胎児まで波及すると脳室周囲白質軟化症を含めた様々な出生児の合併症を誘発するため、炎症の波及を抑える治療が望まれるが根本的な治療法はいまだ確立されておらず、子宮収縮抑制剤、抗生剤投与により妊娠期間の延長を試みるしかないのが現状である。
　Mitogen-activated protein kinase（MAPK）経路は、生体のストレス応答において中心的な役割を担う細胞内シグナル伝達経路である。MAPK経路は3種類のセリン/スレオニンキナーゼ：MAP kinase kinase kinase（MAP3K）、MAP kinase kinase（MAP2K）、MAPKから構成され、MAP3KはMAP2Kを、MAP2KはMAPKをそれぞれリン酸化する。最終的にリン酸化されたMAPKはアポトーシスや細胞増殖、分化に関与する。MAPK経路はがんや自己免疫性疾患、細菌感染などの様々な疾患に関与することが知られており、感染が原因である早産発症にMAPK経路が関与している可能性は十分に考えられる。実際にMAPKであるp38やc-JunN-terminal kinase（JNK）が早産での過剰な炎症性サイトカインの産生を惹起し、早産の発症を促す可能性について報告はみられるが、どのように上流からのシグナルを受け、早産に至る過剰な炎症反応を惹起するのか、その詳細な機序は未解明である。そこで本研究ではMAPK経路の最も上流に存在するMAP3KであるApoptosissignal-regulatingkinase1（ASK1）に着目し、2種類の遺伝子改変マウスとヒト絨毛膜脱落膜の組織培養系にてASK1の早産発症への関与について検証した。

【方法】
　Wildtype（WT）マウスとASK1欠損マウス（ASK1-/-マウス）の妊娠15日目のマウスに、大腸菌リポ多糖（Lypopolysaccaride：LPS）を子宮頸管内に投与し、ウェスタンブロット法で子宮頸管内投与によるASK1、p38、JNKのリン酸化状態の検討を行った。妊娠15日目にLPSを子宮頸管投与し、WTマウスとASK1-/-マウス間での早産率を比較した。さらに定量的Real-time reverse-transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）、免疫組織化学法を用いて、LPS投与後の腹腔内、子宮体部内の炎症性サイトカインの発現、マクロファージの子宮頸部への浸潤、マトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metalloproteinase：MMP）の遺伝子発現を含め早産に関連した炎症に伴う変化を確認した。早産における活性酸素種（Reactive oxygen species：ROS）とASK1の活性化の関連性についてウェスタンブロット法、免疫組織化学法にて検討した。さらにASK1の治療的効果を探るため、ATPアナログの投与によりASK1活性の阻害ができる遺伝子改変マウスである、ASK1- analog-sensitive kinase allele（ASKA）マウス（ASK1ASKAマウス）を用いて早産率を比較検討した。ヒト絨毛膜脱落膜の組織培養系を用いて、LPS添加によるASK1リン酸化シグナルと炎症性サイトカインとMMP遺伝子発現について検討を行った。

【結果】
　LPSの子宮頸管内投与により、子宮頸部、子宮体部ともに、LPS投与後のWTマウス群において、phosphate buffered saline（PBS）群に比べASK1のリン酸化状態が亢進していた。また、ASK1-/-マウスでは、LPS投与後のp38、JNKのリン酸化状態がWTマウスに比べ抑制されていた。LPS投与後48時間での早産率はWTマウスで73％（12/15匹）、ASK1-/-マウスでは40％（6/15匹）とASK1-/-マウスで有意に早産率の低下を認め、腹腔内、子宮体部での炎症性サイトカインの発現、子宮頸部へのマクロファージの浸潤、子宮頸部でのMMP8の遺伝子発現もWTマウスに比べ抑制されていた。LPS子宮頸管投与により、免疫組織化学法で子宮体部にROSが発生したことを確認し、抗酸化剤投与により、ROSの発生が抑制され、LPSによるASK1、p38、JNKの活性も抑制されることを確認した。ASK1ASKAマウスにLPSとATPアナログを同時に頸管投与した早産率はWTマウスではLPS投与48時間までに61％（8匹/13匹）であったのに対し、ASK1ASKAマウスでは20％（2匹/10匹）と、有意に早産率の低下を認めた。ヒト絨毛膜脱落膜にLPS、ASK1阻害剤であるK811を添加したところ、LPS添加により、ASK1およびp38、JNKは活性化し、K811の投与によってASK1およびp38、JNKの活性化は減弱した。LPS刺激により観察された絨毛膜脱落膜での炎症性サイトカインの発現、MMP8遺伝子発現上昇は、K811の投与により有意に抑制された。

【考察】
　上記の結果は、ASK1が、LPSにより発生したROSを感知して活性化し、JNKおよびp38経路の制御を介して早産を誘導する炎症反応を惹起することで、早産を促すように寄与していることを示唆していた。本研究の成果は、早産の病態機序におけるストレスシグナル伝達経路としてのMAPK経路の重要性を示し、さらにはMAP3Kレベルからの制御機構が重要であるという、早産のみならず、産科疾患の病態研究では全く新しい知見となる。
　また、ASK1ASKAマウスやヒト絨毛膜脱落膜を用いた検討から、ASK1活性化の阻害が、LPSによる早産や炎症性の変化に対して、抑制的に作用することを示した。ASK1は細胞がストレス条件下に曝された時のみ活性化されストレス応答においてその機能を発揮する分子であり、定常状態における生体のホメオスタシスの維持においてはその機能は確認されていない。早産において感染を契機としたROSの亢進により活性化されるASK1を標的として阻害することは、早産を惹起する過剰で病的な炎症反応を抑制するのみで、妊娠の恒常性維持や細菌による生体防御機構を阻害することはないだろう。すなわち、早産の発症におけるASK1活性の阻害は、早産や胎児障害につながる過剰な免疫応答のみを抑制し、抗炎症と早産の抑制を同時に実現可能な、理想的な治療戦略となる可能性を秘めていると考える。

【結語】
　マウスおよびヒト絨毛膜脱落膜を用いた検討により、炎症により誘導される早産の病態機序において、ASK1は、JNKおよびp38経路の制御を介して炎症を誘導し、早産を促す機能を有することを示した。さらには、ASK１活性化の阻害が、早産に対する有力な治療戦略となりうる可能性も示した。

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参考文献

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