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顎下腺舌下腺純唾液に含有される代謝物の包括的探索

石川, 明日香 大阪大学 DOI:10.18910/82165

2021.03.24

概要

【研究目的】
今日,癌をはじめとした様々な非感染性疾患の早期発見に体液のバイオマーカー測定法が活用されている.血液や尿に含有される物質を用いたものが主流である一方,低侵襲,安価で簡便に採取可能な唾液を試料としたバイオマーカー測定の実用化が待たれている.唾液中の生体代謝物(メタボライト)はゲノム情報の最終的な表現型であり,疾患実態を鋭敏に反映するバイオマーカーとして利用できる可能性がある.しかし,吐出法により採取した唾液には宿主由来の代謝物に加え口腔内に存在する食渣や微生物由来の成分が混在している.また,宿主由来の代謝物を口腔微生物叢が消費・変性してしまう可能性もある.従って,全身疾患のマーカー探索を目的とした場合,吐出やスワブ等を用いた唾液の採取方法では,唾液分泌後の修飾要因により分析結果の解釈が困難になると考えられる.そこで本研究では,唾液腺開口部から分泌された直後の純唾液を試料として微量メタボローム解析を実施するために必要な唾液採取方法の至適化を検討した.

【方法】
Ⅰ.純唾液の採取法の考案
1.純唾液を担持する濾紙の選定・洗浄方法の検討
微量解析を可能とするために,濾紙中の夾雑物の除去方法を検討した.

2.純唾液採取方法
大唾液腺の安静時唾液の8割を分泌する舌下腺顎下腺開口部の位置する舌下小丘・舌下ヒダより純唾液を採取した.その際,口腔内に貯留する全唾液を採取しないよう,可及的に全唾液を吸収,排除する手法を検討した.

3.溶出効率の検討
担持媒体から抽出液への溶出効率を向上させるための超音波処理方法について,その詳細な条件を検討した.

4.抽出溶媒の検討
抽出効率を向上させるため,複数の抽出溶媒の組成を比較検討した.

Ⅱ.純唾液と全唾液に含有される代謝物質の検討
1.被験者
被験者は本研究に同意を得られた成人30名とした.本研究は大阪大学歯学研究科倫理委員会の承認を受けて実施した(H28-E40-2).

2.純唾液採取用濾紙
純唾液採取に利用する濾紙は2回の洗浄の工程を経て準備した.上記洗浄方法にて決定した方法にて1回目の洗浄後,濾紙を-30℃保存し,採取を行う前日に使用枚数分のみ再度洗浄した.

3.純唾液と全唾液の採取
純唾液は採取日の9時から10時の間に8時間前より絶飲絶食を指示した被検者より採取した.あらかじめ全唾液を可及的に除去し,顎下腺舌下腺の開口部が存在する舌下小丘・舌下ヒダ粘膜表面を乾燥させた後,洗浄済み濾紙にて純唾液を採取した.濾紙は超純水に浸漬させバイアル中で前処理までの間4℃保存した.全唾液は,氷上に留置させたコニカルチューブに安静時唾液を5mL吐出させることで採取した.

4.採取した唾液の前処理とGCMS分析
純唾液は,前述の検討によって至適化した方法に従い抽出した.全唾液については,回収後全ての被験者の全唾液を混合したクオリティーコントロール用(QC)サンプルを作製し全唾液サンプルとした.QCサンプルを濾紙に吸収させ,純唾液と同様の抽出処理を行うことで抽出方法の再現性を確認した.抽出後の試料は遠心濃縮,凍結乾燥後,メトキシアミンピリジン液とMSTFAを添加して誘導体化を行った.質量分析にはGCMS-QP2010(島津製作所)を用いた.

5.統計学的分析
まず主成分分析(PCA)を行い,濾紙から抽出して測定した全唾液QCサンプルの測定結果の再現性について確認を行うとともに,純唾液メタボロームとの差異が存在することを確認した.次に直交部分的最小二乗回帰判別分析(OPLS-DA)を用いて多変量解析を行い,両群を特徴づける物質のvariable importance of projection(VIP)値を算出した.また,volcano plotにより,個々の代謝物について,両群間での相対比と,ウェルチのt検定により算出したp値のFDRによる補正値に基づく分布を示した.さらに純唾液と全唾液の相対比2以上かつ補正済みp値0.05以下の物質を用いてmetabolite set enrichment analysis(MSEA)を実施した.

【結果】
Ⅰ.純唾液試料調整法の至適化
1.唾液腺唾液を担持する濾紙の選定・洗浄方法の検討
①水洗浄,②水・エタノール混合液による洗浄,③エタノール洗浄における濾紙ブランクのTIC(トータルイオンクロマトグラム)を比較したところ,②水・エタノール混合液による洗浄を行ったときに最も効果的に夾雑物が排除された.

2.溶出効率の検討
超音波処理を実施した場合,実施しなかった場合よりも多くのピークが検出された.処理時間と処理回数の組み合わせにより,効率的な溶出条件を決定した.

3.抽出溶媒の検討
唾液試料の抽出溶媒を水・メタノール・クロロホルムにて抽出した場合と水・アセトニトリルで抽出した場合のTICを比較したところ,水・アセトニトリルで抽出した場合の方が多くのピークが検出可能であった.

Ⅱ.純唾液と全唾液に含有される代謝物質の解析
1.試料採取・処理の再現性の評価
PCAスコアープロットで,全唾液と純唾液の両群の分離が確認された.複数の全唾液QCサンプルがほぼ同じ位置にプロットされたことから,試料の抽出および測定方法の高い再現性が示された.

2.採取方法の違いによって量的変化が生じた代謝物の同定
OPLS-DAの結果,純唾液群で40物質,全唾液群で13物質がVIP値1以上を示した.また純唾液と全唾液の相対比2以上かつp値0.05以下の物質をvolcano-plotにて抽出したところ,純唾液群で78物質,全唾液群で16物質がその基準を満たしており,そこにはVIP値1以上の物質がすべて含まれていた.

3.採取方法の違いによって量的変化が生じた代謝経路の同定
Volcano-plotにて同定された,両群を特徴づける物質群を用いてMSEA解析を行ったところ,純唾液群ではバリン・ロイシン・イソロイシン生合成,タウリン・ハイポタウリン代謝,アミノアシル-tRNA生合成,ガラクトース代謝,プリン代謝の5つの経路,全唾液群ではグルタチオン代謝の1経路がそれぞれの唾液を特徴づける代謝経路として同定された(p<0.05).

【結論及び考察】
本研究では,従来の唾液メタボロミクス研究に用いられていた全唾液解析方法とは異なり,より宿主の全身状態を反映する可能性の高い純唾液の微量解析方法を考案した.また,新規の唾液試料調整法を用いてヒト全唾液と純唾液の代謝物プロファイルの比較を行い,その異同を示した.純唾液を特徴づける物質にはこれまで全身疾患のバイオマーカーとして報告されてきた物質が含まれている一方,全唾液を特徴づける物質には歯周疾患の重症度と連関するバイオマーカーが含まれていた.本研究により,解析の目的に応じて唾液試料採取方法を選択する必要性が示唆された.

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