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細胞シート工学を用いたヒト立体拍動組織作製の試み

乾, 明敏 東京大学 DOI:10.15083/0002006194

2023.03.24

概要

[課程-2]
審査の結果の要旨
氏名 乾

明敏

本研究は、末期重症心不全に対する根本的治療法である心臓移植がドナー不足により年
間症例数が限られているため、移植に代わる治療として人工臓器や再生医療の研究が進ん
でおり、厚みを持った心筋組織の再生・作製が試みられている現状において、ヒト iPS 細
胞由来心筋細胞シートとブタ小腸血管床を生体外においてバイオリアクターを用いて灌流
培養することで、ヒト立体拍動組織を作製することを試みたもので、下記の結果を得てい
る。

1.

平面状血管床としてブタ大網及び小腸を検討した結果、前者は静脈が細いという解剖
学的理由で灌流培養が困難であり、肉眼的に脂肪組織や結合組織に乏しくハンドリン
グ困難で組織工学での使用には不向きであった。また、墨汁を注入したところ大網の
一部の領域しか黒色に変化せず、この点からも灌流培養が困難であると考えられた。
Azan 染色では、細胞外マトリックスや血管に乏しいことが判明した。一方、ブタ小腸
は大網と比較すると粘膜や粘膜下層など、十分な組織量を認め、墨汁の注入を行った
ところ小腸のほぼ全ての部位が均一に染まり、Azan 染色の結果、結合組織に富むこと
が示された。また、小腸と大網の血管数を比較したところ小腸の血管数が有意に多か
った。本結果から、ブタ小腸を腸間膜の対側で切開して粘膜切除を行うことで平面状
血管床として使用可能であることが示された。

2.

本実験ではヒト iPS 細胞として 201B7 株 (RIKEN)を使用した。心筋細胞はヒト iPS 細
胞から、文献に報告されている方法により誘導されたが、得られた心筋は自発的に拍
動することが顕微鏡レベルで確認された。誘導された心筋細胞を GFP-HUVEC 及び
NHDF と共に温度応答性培養皿で 5:1:5 の比率で共培養したところ、血管網付与のた
めに必要な前毛細血管状態と考えられる血管ネットワークを持つ拍動する心筋細胞シ
ートが作製された。

3.

温度応答性培養皿から回収された心筋細胞シートは 3 層に積層された後、ブタ小腸粘
膜下層の上に搭載され、バイオリアクターを用いて灌流培養が開始された。先行実験
の結果から、灌流中の圧は 40mmHg を目標としたが、正常に灌流された場合は組織の
壊死は認めなかった。灌流開始翌日より肉眼的にシートの拍動が確認されるようにな
り、6 日間の灌流培養中は継続して拍動を認めた。電気生理学的検査では、灌流培養
終了直前の 6 日目において平均拍動数 105±13 回/分 (n=8)の整である活動電位を認め
た。なお、長期の灌流培養を検討する目的で 8 及び 11 日間の灌流培養を行った検体も

存在するが、組織やシートの壊死は認めなかった(それぞれ n=1)。
4.

6 日間の灌流培養後もブタ小腸血管床と積層された心筋シートの性状は良好で、壊死
を起こすことなく灌流培養が成り立つことが確認された。積層された心筋シートと血
管床との間に他の組織や空間はなく、良好な接着が確認された。灌流培養終了後に動
脈から墨汁を注入したところ、血管床だけでなく心筋シート内にも墨汁が到達するこ
と確認した (n=5)。免疫染色では、6 日間の灌流培養後も作製心筋組織内において積載
した細胞シート由来の心筋細胞が生着していること、及び血管内皮細胞が環状構造を
形成していることが判明した。血管内皮細胞は GFP 陽性であり、細胞シート由来であ
ることが確認された。また心筋組織内に構築された GFP 陽性血管内に墨汁が存在する
ことも確認された。これらの結果は、部分的ではあるが血管床と心筋シートの間に 6
日間の灌流培養によって血管新生が生じたことを示している。

5.

作製した 3 次元心筋組織が移植可能であるかを検討するため、ブタへの移植実験を行
った (n=1)。ブタ小腸血管床にヒト iPS 細胞由来心筋細胞シートを積載して 4 日間灌
流培養を行った後、血管付き心筋組織はバイオリアクターから取り出された。なお灌
流培養の間、心筋細胞シートは拍動を続けており、組織壊死等の異常は認めなかっ
た。取り出した組織の小腸血管床動静脈を、別のブタの内胸動静脈にそれぞれ端々吻
合することで移植を行った。血流再開後、速やかに血管床への血流が確認された。バ
イオリアクターから取り出してから血管吻合による血流再開までの間は灌流が中止と
なるため、心筋細胞シートの拍動は認めなくなったが、血流再開後数分経過すると小
腸に搭載された心筋細胞シートの拍動を再度認めるようになり 1 時間以上継続するこ
とが確認された。灌流培養中は培地が使用されていたが、実際の血液で灌流された場
合にも拍動を認める事実は、灌流培養により組織の viability が保たれていることを示
している。
以上本論文は、ヒト iPS 細胞由来心筋細胞を GFP-HUVEC 及び NHDF と共培養すること

で血管内皮細胞ネットワークを持つ心筋細胞シートを作製した後、心筋細胞シートを 3 層
に積層化してブタ小腸血管床(脱粘膜済、平面状)の上に搭載してバイオリアクター内で
灌流培養を行うことで、生体外での臨床応用可能な血管付きヒト心筋組織の作製を試み
た。培養開始翌日には自発的で規則的な拍動を認め、6 日間の灌流培養の後、細胞シート
内の血管内皮細胞とブタ小腸血管床内の毛細血管が接続して血管新生が起こることを確認
しており、作製組織の他のブタへの移植にも成功している。本研究のコンセプトを応用し
て今後作成される心筋組織は、物理的な拍動による心機能・循環動態の直接補助による改
善というこれまでにない治療効果をもたらし、重症心不全患者に対する新しい治療の開発
に貢献すると考えられる。
よって本論文は博士(医学)の学位請求論文として合格と認められる。

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63

8 謝辞

本研究は国立研究開発法人日本医療研究開発機構 (AMED) の「立体造形によ

る機能的な生体組織製造技術の開発」事業において選定された「細胞シート工

学を基盤とした革新的立体臓器製造技術の開発」の一部として行われました。

また、日本学術振興会 (JSPS) からの科研費も使用されました。

本研究の機会を頂き、終始近接なるご指導を賜りました東京大学大学院医学

系研究科外科学専攻心臓外科・小野稔教授、東京女子医科大学先端生命医科学

研究所・清水達也教授、関根秀一講師に深く感謝いたします。

本研究を遂行する際、バイオリアクターを供給してくださった株式会社東海

ヒット・佐野和紀氏、技術的なご指導を賜りました東京女子医科大学先端生命

医科学研究所・土橋泉氏、吉田杏美氏、ヒト iPS 細胞を培養し、ヒト心筋細胞に

分化誘導させて供給してくださった東京女子医科大学先端生命医科学研究所・

松浦勝久准教授、ブタ小腸採取手技・移植手技のご指導を賜りました慶應義塾

大学医学部臓器再生医学寄付講座・小林英司教授には厚く御礼申し上げます

また、本研究を遂行する上でご尽力くださった、東京女子医科大学先端生命

医科学研究所の皆様方、東京大学医学部附属病院心臓外科、呼吸器外科の諸先

生方には心から感謝いたします。

64

...

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