論文の公開元へ不織布構造ゼラチン基材の前留置期間が皮下膵島移植のグラフト生着へ及ぼす影響に関する検討
概要
博士論文
不織布構造ゼラチン基材の前留置期間が皮下膵島移植
のグラフト生着へ及ぼす影響に関する検討
東北大学大学院医学系研究科医科学専攻
外科病態学講座消化器外科学分野
齊藤 竜助
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目次
1. 要約 ······························································································································· 3
2. 研究背景 ························································································································· 6
3. 研究目的 ························································································································· 9
4. 実験方法
Ⅰ
実験動物 ······················································································································· 10
Ⅱ 糖尿病マウスの作製 ······································································································· 10
Ⅲ
膵島分離と培養方法 ······································································································ 11
Ⅳ
GHNF の前留置と膵島移植 ····························································································· 11
Ⅴ 腹腔内ブドウ糖負荷試験 ································································································· 12
Ⅵ
免疫組織化学染色 ········································································································· 12
Ⅶ リアルタイム PCR による遺伝子発現解析 ········································································· 14
Ⅷ
Ⅸ
イムノアッセイによる炎症性メディエーターおよび膵島保護因子のタンパク質発現解析 ·········· 15
統計学的処理 ··············································································································· 16
5. 実験結果
Ⅰ
膵島移植後の血糖値の推移と治癒率 ··················································································· 17
Ⅱ 腹腔内ブドウ糖負荷試験 ································································································· 17
Ⅲ
留置期間に伴う皮下 GHNF の変化···················································································· 17
Ⅳ
免疫組織化学染色 ········································································································· 18
Ⅴ リアルタイム PCR による遺伝子発現解析 ··········································································· 19
Ⅵ
炎症性メディエーターおよび膵島保護因子のタンパク質発現解析 ·········································· 19
6. 考察 ······························································································································ 21
7. 結論 ······························································································································ 27
8. 謝辞 ······························································································································ 28
9. 図 ································································································································· 29
10. 略語 ···························································································································· 55
11. 参考文献 ······················································································································ 57
2
1. 要約
【研究背景】膵島移植は重症 1 型糖尿病に対する治療法の一つであり、膵臓移
植と比べて低侵襲である。現在の膵島移植では、膵島を経門脈的に肝臓内に移植
する方法が標準的である。しかし、肝内の原始免疫反応による膵島破壊、出血、門
脈塞栓などの合併症の問題があり、最適な移植部位とは言い難く、新たな移植部
位の探求が行われている。そこでより低侵襲で、アクセスが容易な皮下膵島移植
が注目されている。しかし、皮下は低酸素であり、血管に乏しいことから移植効率
が悪く、細胞外マトリックス（extracellular matrix；ECM）や新生血管誘導による移
植環境の最適化が必須である。実際、Ⅰ型コラーゲン素材であるリコンビナントペ
プチド（recombinant peptide；RCP）を皮下に前留置し、そこに膵島を移植すること
で移植成績が向上することが報告されている。興味深いことに、RCP の生着促進
効果は留置期間が短いと発揮されないことも明らかとなっている。しかし、RCP は
移植時に取り除く必要があり、その際に構築された ECM や新生血管が破壊される
懸念があった。そこで本研究においては、生体吸収性の不織布構造ゼラチン基材
（gelatin hydrogel nonwoven fabric；GHNF）に着目した。GHNF は最終的に自己細
胞に置換されるため、膵島移植時に摘出する必要が無く、実際、GHNF の前留置に
より、マウス皮下膵島移植の成績は標準法である門脈移植を凌駕することが判明
している。しかし GHNF の至適留置期間は未だ不明であるため、本研究では、ま
3
ず GHNF の前留置期間が皮下膵島移植の成績に影響を与えるかどうかを検討した。
また、その機序の解析を通し、皮下膵島移植の成功要因の同定を試みた。
【研究方法】レシピエントマウス（C57BL/6JJmsSlc マウス）の膵島移植予定部位
の皮下に、2 枚の GHNF の間にスペーサーとしてシリコンを挟んで留置した。前
留置の期間で、2 週間（2W 群）、4 週間（4W 群）、6 週間（6W 群）、8 週間（8W
群）の 4 群を設定し、270 IEQs（islet equivalents；膵島量）の同種同系膵島移植を
行った。移植 7 日前に Streptozotocin（STZ）を投与し糖尿病を誘導した。膵島移植
は、シリコンを除去した皮下のスペースに行った。移植後は、血糖と体重の推移を
観察し、腹腔内ブドウ糖負荷試験にてグラフトの耐糖能を評価した。また、皮下組
織の免疫組織化学染色、炎症性メディエーター及び膵島保護因子のタンパク、遺
伝子発現解析を施行し、皮下移植部位での血管新生、ECM、炎症状況を評価した。
【研究結果】膵島移植後の血糖値と治癒率は、6W 群が他の群と比べ有意に良好な
値を示した（血糖値; p<0.001 、治癒率; p=0.0049）。また、腹腔内ブドウ糖負荷試
験でも同様に、6W 群が他の群と比べ有意に良好な値を示した（p<0.001）。免疫組
織化学染色の結果、膵島移植前の GHNF 周囲被膜および膵島移植後の膵島周囲間
質での von Willebrand factor（vWF）陽性血管数は、6W 群で他群よりも有意に増加
していた（p<0.001）。膵島周囲線維被膜部の ECM 陽性切片の割合は、経時的な増
加傾向が見受けられ、8W 群のラミニン、コラーゲンⅢ、コラーゲンⅣにおいて他
4
群よりも有意に高値を示した（p<0.001）。GHNF 内および周囲の被膜内の CD206
陽性細胞は 2W 群が最も多く、経時的に減少する傾向が見受けられた（p<0.001）。
また、種々の炎症性サイトカインが 2W 群で高値を示し、その後 GHNF の留置期
間に応じて徐々に減少したが、8W 群で再上昇する傾向が確認された。さらにリア
ルタイム PCR により、6W 群においては 2W 群に比し、種々の ECM、血管新生、
膵島保護因子を含む 21 遺伝子の発現が有意に上昇することが判明した。
【結論】本研究により、GHNF の前留置期間が皮下膵島移植の成績に大きな影響
を及ぼすことが明らかとなった。
皮下移植部位における新生血管構築、
ECM 補填、
GHNF 残存量、炎症惹起レベル、膵島保護因子の放出量の各要因がいずれも皮下
膵島移植成功の鍵を握っており、これらの複合的バランスにより GHNF の至適留
置期間が決定され、
本研究におけるマウスモデルでは 6 週間が最適と考えられた。
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2. 研究背景
1 型糖尿病は、インスリンを産生する膵ランゲルハンス島β細胞が、自己免疫
によって破壊されることで引き起こされる自己免疫性疾患である。1 型糖尿病に
対する移植療法の主流である、臓器そのものを移植する膵臓移植は、外科的侵襲
が大きく、周術期合併症が起こりやすいという欠点を抱えている 1。一方膵島移植
は、特殊な細胞分離用酵素剤でドナーの膵臓から膵島のみを分離、回収し、レシピ
エントの門脈内に点滴することで血糖をコントロールする治療であるため、膵臓
移植に比べて、より低侵襲で安全な移植療法である。
膵島移植は 2000 年以降本格的に臨床応用されるようになり 1、近年では重症
糖尿病患者の血糖コントロールに有用な治療法と位置付けられている 2。本邦でも
2020 年 4 月から保険診療が開始され、今後一般医療への発展が期待されている。
しかし目覚ましい技術の進歩にもかかわらず、一人の患者の治癒に複数のドナー
を必要とするといった課題が残存している。
現行の膵島移植は、分離した膵島を経皮経門脈的に肝臓内に移植する方法が世
界標準であるが、いくつかの問題点が存在する 1。まず、肝内は原始免疫反応が亢
進しているため、移植膵島が門脈血に接すると Instant Blood-Mediated Inflammatory
Reaction と呼ばれる激しい炎症反応が生じ、移植後数時間で多くの移植膵島が破
壊される
3-5
。また、移植手技に伴い出血、門脈塞栓、門脈圧亢進などの合併症の
6
危険性も指摘されている
6-9
。さらに今後、ドナー不足解消のため人工多能性幹細
胞由来膵島や異種膵島の移植が実施された際に、感染や腫瘍化など移植膵島に起
因する合併症が生じても、肝臓内に移植された膵島を摘出することは不可能であ
る 1。以上の理由から、経門脈移植は膵島移植にとって最適な移植部位とは言い難
く、新たな移植部位の探求が膵島移植分野における重要な研究テーマの一つとな
っている 10,11。
種々の移植部位候補の中でも、特に皮下への膵島移植は低侵襲であり、多くの
利点を有することから最適な候補の一つと考えられている
12
。皮下はアプローチ
が容易であるため複数回の移植を安全に実施することが可能であり、超音波検査
や生検により移植膵島のモニタリングも容易である。感染や腫瘍発生など移植膵
島に起因する合併症が生じた際に、必要に応じて移植膵島を迅速に摘出すること
も可能である 13,14。その一方で、皮下は血管に乏しく、移植膵島へ酸素や栄養を十
分に供給できないため、経門脈移植に比べて移植効率は極めて不良である
15
。そ
のため、細胞外マトリックス（extracellular matrix; ECM）や新生血管の誘導による
移植環境の最適化が、膵島の生着向上のためには必要である。
私の所属する研究室ではこれまでに、Ⅰ型コラーゲン素材であるリコンビナン
トペプチド（recombinant peptide；RCP）を皮下に前留置することで皮下膵島移植
の成績が向上することを報告してきた 16。この実験では、10 日間の前留置期間で
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は効果が不十分であるが、RCP を 4 週間前留置することで、門脈移植と同等の治
癒率をもたらすことが判明した。しかし、RCP は吸収に極めて長期間を要するた
め膵島移植時に取りだす必要があり、その過程で構築された ECM や新生血管が破
壊されるという懸念があった。
そこで本研究においては、生体吸収性で除去する必要がないデバイスである
不織布構造ゼラチン基材（gelatin hydrogel nonwoven fabric ; GHNF）17 に着目した。
GHNF はゼラチンをブロー法で繊維化した後、脱水熱架橋して作製されたゼラチ
ン不織布である。細胞を GHNF 内で培養すると、細胞の増殖に伴いゼラチンが分
解されることで細胞や ECM に置き換わることが判明している 18,19。また、ゼラチ
ンそれ自体が、移植細胞の生着および血管新生を促すという報告も見受けられ、
特記に値する 20,21。 GHNF はこういったユニークな特性を有しているため、移植
時に摘出する必要が無く、新たに構築された新生血管や ECM を保持したまま移植
を行うことが可能である。実際、GHNF の前留置により、マウス皮下膵島移植の成
績は標準法である門脈移植の成績を凌駕することが判明している（論文投稿中）。
その要因として、移植部位である皮下組織におけるラミニン、コラーゲンⅢ、コラ
ーゲンⅣといった ECM の補填、
および膵島保護作用のある insulin-like growth factor
2 （IGF-2）、 hepatocyte growth factor （HGF）などの成長因子の関与が考えられ
8
た。しかし、GHNF の前留置期間が移植結果に影響を及ぼすのか、またそうであれ
ば最適な留置期間がどの程度であるのかについては不明である。
そこで本研究では、まず GHNF の前留置期間が皮下膵島生着へ及ぼす影響を
検証した。さらに、その機序の解析を通し、皮下膵島移植の成功要因の同定を試み
た。
3. 研究目的
本研究の目的は、GHNF の前留置期間が皮下膵島生着へ及ぼす影響を検討し、
最適な留置期間を明らかにすることである。さらにその機序の解析を通し、皮下
膵島移植の成功要因の同定も試みる。
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4. 実験方法
Ⅰ.
実験動物
本研究における動物実験は、「東北大学における動物実験等に関する規程」に従い
（承認番号: 2020 医動-022）、米国の National Institutes of Health により発行された
“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals（1996 年改訂版）”に基づき施行した
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。全ての手術手技は、適切な麻酔下に最小限の苦痛となるよう施行された。本研究
の膵島移植実験は、生後 6 週から 14 週の雄性 C57BL/6JJmsSlc マウス（Japan SLC、
Inc.、Shizuoka、Japan）をドナーおよびレシピエントに使用する同種同系移植モデルを
用いた。
Ⅱ. 糖尿病マウスの作製
糖尿病マウスは、膵島移植 7 日前に 170 mg/kg 体重の STZ（Sigma-Aldrich、St. Louis、
MO、USA）を静脈内投与することで誘導し、随時血糖が 400 mg/dL 以上を 2 回連続
して認めた場合を糖尿病マウスと判定した。
また膵島移植後は移植後 60 日まで 3-4 日
に 1 回随時血糖を測定し、随時血糖 200 mg/dL 未満を 2 回連続して認めた場合を糖尿
病治癒と判断し、200 mg/dL 未満となった最初の日を治癒日とした。
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Ⅲ.
膵島分離と培養方法
イソフルレン吸入麻酔下でドナーマウスの下大静脈切断による脱血を行った後に、
1 mg/mL の collagenase type Ⅴ（Sigma Chemicals、St. Louis、MO、USA）を含む冷 HBSS
（Hank’s balanced salt solution）2 mL を実体顕微鏡下で総胆管より膵臓内に注入し膵臓
を膨張させ、膵臓を摘出した。摘出した膵臓に 10 mL の HBSS を加えた後、37℃で 12
分 間 温 浴 さ せ る こ と に よ り 膵 組 織 を 消 化 し た 。 続 い て Histopaque-1119 （ Sigma
Diagnostics、St. Louis、MO、USA）と LymphoprepTM（Axis-Shiled、Oslo、Norway）を
用いた濃度勾配遠心を行い、膵島を分離、回収した。回収した膵島を 5.5 mmol/L グル
コースと 10%ウシ胎仔血清を含む Roswell Park Memorial Institute-1640 培地に懸濁し、
37℃、5％CO2 下で一晩培養した後に移植した 23。
Ⅳ.
GHNF の前留置と膵島移植
本研究においては、GHNF（Genocel®；NIKKE MEDICAL Co.、Ltd.、Osaka、Japan）
の前留置期間を 2 週間（2W 群; n=11）、4 週間（4W 群; n=16）、6 週間（6W 群; n=15）、
8 週間（8W 群; n=13）とする 4 群を設定した。イソフルレン吸入麻酔下で、レシピエ
ントマウスの左背側を約 2 cm 切開し、皮下を鈍的に剥離して十分なスペースを形成
した。直径 11 mm、厚さ 0.5 mm の円形シートタイプの GHNF を生理食塩水で膨潤さ
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せた後、GHNF 2 枚の間に直径 11 mm、厚さ 0.5 mm のシリコンシートを挟み、左背側
のスペースに留置した（図 1）。
膵島移植時にマウス皮下からシリコンシートのみを抜去し、そのスペースに約 270
IEQs（1 IEQ は直径 150 m の膵島 1 個相当の大きさに該当することが国際基準で定
められている）の膵島を、20 G サーフローを接続した気密シリンジ（Hamilton Co.、
Reno、NV、USA）を用いて移植した 16。
Ⅴ.
腹腔内ブドウ糖負荷試験
腹腔内ブドウ糖負荷試験 （intraperitoneal glucose tolerance test；IPGTT） は、移植後
60 日から 64 日目の間に行った 24。12 時間の絶食後、血糖値と体重を測定した後、10%
D-glucose （1.0 g/kg） を腹腔内に投与し、5、10、15、20、25、30、45、60、90 およ
び 120 分後の血糖値を測定した。各時間の血糖値から曲線下面積（Area Under the
Curve；AUC）を算出した。
Ⅵ.
免疫組織化学染色
GHNF を皮下留置後 2、4、6、8 週に膵島移植前の皮下組織を摘出して、免疫組織
化学染色を施行した（2W 群; n=5、4W 群; n=5、6W 群; n=5、8W 群; n=5）。また、皮
下膵島移植後 60 日目に皮下組織を摘出し、移植後標本として免疫組織化学染色を施
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行した（2W 群; n=5、4W 群; n=8、6W 群; n=6、8W 群; n=4）。摘出した組織は、4%パ
ラホルムアルデヒドで一晩固定後、パラフィンで包埋し薄切切片を作製した。
膵島移植前の皮下組織については、各群における GHNF の残存程度を観察するため
にヘマトキシレン・エオジン染色を行った。また、GHNF の周囲に形成された被膜の
新生血管を評価するために血管内皮細胞で産生される von Willebrand factor（vWF）の
染色を行い 25、GHNF 内部および周囲線維性被膜内の抗炎症性 M2 マクロファージを
評価するために CD206 染色を行った。膵島移植後の皮下組織に関しては、vWF によ
り膵島周囲間質における新生血管を評価し、さらに移植後膵島周囲の ECM の発現を
調べるため、繊維性コラーゲンであるコラーゲンⅢ 26、基底膜の主要な構成タンパク
であるコラーゲンⅣ、ラミニンを染色した 27。 ...
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