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腎うっ血における腎障害とイマチニブメシル酸塩による腎保護効果の検討

松木 琢磨 東北大学

2020.03.25

概要

心臓と腎臓には、心腎連関と呼ばれる体液量・血行動態の恒常的な調整機構がある。近年、中心静脈圧の上昇が腎障害の原因となっていることが示された。我々は中心静脈圧の上昇、すなわち腎静脈圧の上昇に伴って腎間質静水圧の上昇と直血管の拡張が腎うっ血による線維化の原因となると仮説を立て、中心静脈を左右腎静脈間で結紮する新たな腎うっ血ラットモデルを作製し、血行動態と分子機序について検討、報告した。この腎うっ血モデルでは、遠位の中心静脈圧のみ上昇して左腎のみうっ血状態となり、右腎はうっ血状態にならず、術後 3 日目に糸球体障害、尿細管間質障害に関連する遺伝子の発現が亢進していた。特にペリサイト-筋線維芽細胞転換(pericyte- myofibroblast transition; PMT) に関連する血小板由来増殖因子受容体(platelet- derived growth factor receptor; PDGFR)の発現が顕著に亢進していた。そして、腎皮膜除去等によって PDGFR 経路を抑制することにより尿細管間質障害が改善した。今回、当該モデルの検証を目的として、右腎臓を正常コントロールとして用いることの妥当性、性差の有無を評価した。加えてチロシンキナーゼ阻害剤の1つであり、 PDGFR 経路の阻害作用を持ち他の腎障害モデルにおいて障害の進展抑制効果が報告されている、イマチニブメシル酸塩(イマチニブ)を用いて我々の腎うっ血モデルにおける尿細管間質障害進展抑制効果を多面的に検討した。

7-9 週齢の Sprague-Dawley ラットの左右腎静脈間で中心静脈を絹製縫合糸で結紮した。雌雄差の検討を除いて全て雄性ラットを用いた。疑似手術群においては、中心静脈、左右腎静脈の同定、それらの周囲結合組織からの剥離まで行い、中心静脈の結紮は行わず閉腹した。生理学的には腎重量の測定、また血液、尿検体から腎機能障害、肝機能障害について評価した。分子生物学的には、定量的 PCR (qPCR)、ウェスタンブロッティングによる評価を行った。組織学的には組織染色、免疫染色、蛍光免疫染色を行い、種々の腎障害マーカー、線維化マーカーについて評価した。また摘出した腎臓について、うっ血による直血管周囲の構造変化を、micro-computed tomography (µCT) により巨視的に、低真空走査電子顕微鏡(low-vacuum scanning electron microscopy; LV-SEM)により微視的に観察した。

イマチニブは、手術前日、手術当日、術後 1 日目、2 日目と計 4 回、腹腔内投与した。対照群は同量の、イマチニブの溶媒として用いた生理食塩水を同量投与した。術後 3 日目に左右の腎臓を摘出し、各種解析に用いた。また屠殺前に膀胱から尿を、下行大動脈から血液を採取した。

イマチニブの効果が PDGFR 経路を介しているかを確認するため、PDGFR に対する選択性が高いクレノラニブを用いて線維化抑制効果を比較する細胞実験を行った。ヒト胎盤由来培養ペリサイトを用い、transforming growth facor-β (TGF-β)により線維化を誘導した。コントロール群に対して、イマチニブ、クレノラニブを投与した群における線維化抑制効果を比較した。

手術や投薬手技に関連して死亡したラットはいなかった。疑似手術群の左右両腎臓と比較し手術群の右腎臓(非うっ血側)は、生理学的、分子生物学的、組織学的に相異なく、正常コントロールとして扱えることが示された。加えて、雌雄についても相異は認められなかった。イマチニブを投与した群では有意に左腎臓(うっ血側)の重量増加が抑制され、組織学的には特に直血管周囲で腎障害、線維化マーカーの上昇が抑制されていた。分子生物学的分析においてもこれに対し支持的な結果が得られた。また µCT、LV-SEM を用いた解析では、腎うっ血により生じた直血管の拡張やそれを取り囲むペリサイトの脱落は、イマチニブ投与群でも変わらず認められた。

ヒト胎盤由来培養ペリサイトを用いた実験では、線維化マーカーの mRNA 発現はイマチニブによって抑制され、イマチニブよりも PDGFR に対して選択性の高いクレノラニブによっても同様の線維化抑制効果がみられた。

今回の検討で、当該モデルで右腎臓を正常コントロールとして用いることが可能と示された。これは個体差による実験結果への影響を緩和しうる点で有用である。また片側の腎うっ血によって発生する、全身性因子の健側への影響が小さいことも示唆された。また、腎虚血再灌流モデルなど性差のみられる実験系と異なり、当該モデルでは雌雄差はみられなかった。腎うっ血によって生じる腎障害は、上昇した間質圧を解除せずともイマチニブによって PMT の活性化が妨げられ、尿細管間質障害の進展が抑制可能であることが示唆された。培養細胞を用いた実験結果からも、PDGFR 経路の阻害と線維化進展抑制に関連があることがうかがわれ、心不全下の腎うっ血による腎障害に対して、PDGFR 経路は新たな治療ターゲットとなる可能性が示された。

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