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小野知二, 東京大学博士論文
序に関する研究
第2章
腸溶性ラクトフェリンの内臓脂肪低減効果とその作用機
第一節
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要旨
「メタボリックシンドローム」
（Metabolic Syndrome; MetS）は、内臓脂肪型肥満に加え、
高血糖・高血圧・脂質異常症のうち、２つ以上を合併した状態と定義され、動脈硬化性疾患
のリスクファクターとして認知されている。近年、生活習慣病の末期である動脈硬化の発症
と内臓脂肪量が強い相関を示すことが明らかにされ、内臓脂肪の蓄積がメタボリックシン
ドローム形成の主な原因の一つであることが認知されるようになった。先進国はもとより、
発展途上国の富裕層においても、栄養過多、運動不足、ストレスの増加などの生活習慣の変
化を背景にし、世界中で MetS の患者が急増し、大きな社会問題となっている。すなわち、
国民の健康維持及び高騰する医療費の抑制には、MetS に罹患する前の内臓脂肪の蓄積を予
防することが非常に重要である。
ラクトフェリン（lactoferrin; LF）は、母乳、特に初乳中に高濃度含まれる事から、新生
児の初期免疫防御に重要な役割を示すことが考えられていたが、近年では、抗菌・抗ウイル
ス作用に加え、様々な生理作用（抗癌、抗貧血、免疫調節、脂質代謝改善等）が報告されて
おり、多機能性タンパク質として認知されている。母乳中に含まれる成分である事から安全
性も高く、ウシ由来 LF 原料に関して、アメリカでは、いわゆる一般的に安全な食品
（Generally Recognized as Safe；GRAS）として登録されている。日本でも、食品添加物
として認可されていることもあり、人の健康に寄与する成分として、様々な分野での基礎研
究及び応用研究が進められている。
我々は、LF のこれら機能のうち、脂質代謝改善作用に着目して研究を進めている。これ
まで、①LF による脂肪細胞分化抑制効果は知られていたが、ラット腸間膜脂肪由来前駆脂
肪細胞を用いた検討において、胃の消化酵素であるペプシンで分解した LF ではその効果が
認められなかったこと、②体内動態解析の結果から、経口投与した LF は腸間膜脂肪組織で
高濃度検出されたこと、以上の 2 点から、我々は、LF が内臓脂肪低減作用を発揮するには、
124
腸溶加工された LF が効果的であろうとの仮説を立てた。そこで、胃での分解を避けるため
に腸溶性 LF（entericLF；eLF）錠剤を用いて、腹部肥満傾向の日本人男女を対象とした二
重盲検群間比較試験を実施した。その結果、8 週間の eLF の摂取により、プラセボ群と比
較して腹部臍帯部の内臓脂肪面積が有意に低下することを確認し、ヒトにおける LF の内臓
脂肪低減効果を証明した。しかしながら、LF の内臓脂肪低減機序についての全貌は明らか
にできておらず、動物モデルの確立が重要課題であった。また、内臓脂肪以外の MetS 症状
に対する効果も未検討であった。そこで本論文では、LF の内臓脂肪低減機序解明を目指し
た動物モデルの確立と、
MetS 諸症状に対する LF の有効性を明らかにする事を目的とした。
まず、内臓脂肪低減効果の作用機序解明に向けたモデル動物の確立を検討した。LF 投与
による内臓脂肪低減モデルはほとんど報告されておらず、先行報告としては、食餌制限条件
において、LF 投与により、内臓脂肪を含む体脂肪率が有意に低下することが報告されてい
た。食餌制限という条件は、MetS の諸症状及び内臓脂肪蓄積を抑制するモデルとしては不
適切であると考え、カロリー制限の無い条件でのモデル確立が重要であると考えた。本条件
においては、内臓脂肪に着目した報告はされておらず、血中脂質パラメータの改善が認めら
れた条件として、通常食摂取の報告が複数されていた。一方、LF が分解されずに腸に届く
ことも重要である。これまでの検討で、混餌投与と比較し、強制胃内投与（ゾンデ投与）の
方が、インタクトな LF 及び iLF 共に小腸への到達量が顕著に多いことを確認していたこ
とから、投与方法を強制胃内投与に設定し、モデル確立を検討した。その結果、通常食の自
由摂取条件における ICR マウスに対し、4 週間 LF（100 mg/body）を強制胃内投与するこ
とにより、腸間膜脂肪重量（蒸留水群；0.43 ± 0.03 g、LF 群；0.28 ± 0.04 g、p < 0.05）
と、肝臓中の中性脂肪（Triglyceride；TG）
（蒸留水群；16.3 ± 1.8 mg/g-liver、LF 群；
6.5 ± 0.7 mg/g-liver、p < 0.01）が有意に減少することを明らかにした。また、本投与条
件において、小腸内に全長 LF が到達していること、および、腸間膜脂肪組織に免疫反応性
LF が到達していることを確認した。これらの結果から、LF の内臓脂肪低減作用を検出可
125
能なモデル動物を確立した。また、内臓脂肪重量と肝臓中の TG 濃度との間に、有意な相関
が認められたことから（R = 0.581、p < 0.05）
、LF の肝臓への作用を確認することが重要
であると考え、次に、MetS の肝臓での表現型といわれる脂肪肝のモデル細胞に対する LF
の直接効果を検討することとした。脂肪肝モデルとしては、肥満およびインスリン抵抗性と
密接に関連する非アルコール性脂肪肝（Non Alcoholic Fatty Liver Disease；NAFLD）モ
デルを選定した。本モデルは、NAFLD の重症度との関連が知られている血中脂肪酸（Fatty
Acid；FA）を脂肪肝の誘導トリガ―としている。本研究では、先行知見に基づき、ヒトの
血中に存在する代表的な FA であるパルミチン酸（C16：0）
、オレイン酸（C18：1）
、リノ
ール酸（C18：2）
、リノレン酸（C18：3）、アラキドン酸（C20：4）の FA 混合物（FA mixture;
FAm）を誘導トリガーとして使用した。FAm 誘導性 NAFLD モデルに対し、LF は 20 μg/mL
の濃度から、FAm（1 mM）によって低下する細胞生存率（レサズリン還元活性）を有意に
上昇させた。一方、細胞内への TG 蓄積には影響を与えなかった。TG の蓄積を抑制せずに、
細 胞 生 存 率 を 回 復 さ せ る こ と か ら 、 FAm に よ っ て 誘 導 さ れ る 細 胞 障 害 （ Lactic
Dehydrogenase；LDH 活性）とアポトーシス（Caspase-3/7 活性）への影響を確認した。
その結果、FAm によって増加した LDH 活性および Caspase-3/7 活性を LF は有意に低下
させたことから、LF は主にアポトーシス経路に作用している可能性が考えられた。次に、
同じく Caspase-3 の活性を誘導するツニカマイシン刺激による ER ストレスに対する作用
を検討した。その結果、LF は、ツニカマイシンによって誘導された Caspase-3/7 活性を阻
害しなかったことから、LF は、Caspase-3 への直接的な阻害効果ではなく、アポトーシス
誘導の途中のシグナル経路を阻害している可能性が考えられた。FA 誘導性のアポトーシス
は主に JNK 経路によって誘導されるという報告に基づき、LF が誘導するシグナル経路と
の交差ポイントを調べた結果、Akt シグナル経路が候補として抽出された。そこで、Akt の
リン酸化阻害剤である Akt inhibitor VIII（50 μM）を用いて、LF の効果への影響を検討し
た結果、LDH 活性に対する LF の効果を有意に減少させると共に、細胞生存率および
126
Caspase-3/7 活性については、LF の効果は完全に消失した。これらの結果から、NAFLD モ
デル細胞に対して、LF は Akt シグナル経路を介して脂肪毒性を減弱することを明らかにし
た。
最後に、高コレステロール血症および動脈硬化症に対する LF の効果を in vivo で明らか
にするため、ヒトと食事・睡眠習慣や脂質代謝機構が近い実験動物であり、かつ、短期間（8
週間）でアテローム性動脈硬化症を誘導可能なマイクロミニピッグ（Porcine）を用いて eLF
の有効性を検討した。その結果、高脂肪・高コレステロール食（HFCD）摂取群と比較して、
HFCD 摂取に加え eLF（500 mg/body/day）を投与した群では、投与第 2 週において、総
Cho および LDL-Cho 値の有意な低下が認められた（総 Cho; 42%低下、p < 0.01, LDL-Cho;
52%低下、p < 0.01）。15 箇所の動脈において、通常食群ではアテローム性動脈硬化病変は
全く観察されなかったのに対し、HFCD 群では、泡沫細胞浸潤を伴う内膜肥厚を示す動脈
が 9 カ所認められた。それに対し、eLF 投与群では、泡沫細胞浸潤が 3 カ所の動脈で認め
られるに留まった。eLF の効果を遺伝子レベルでも確認するため、DNA マイクロアレイ法
に よ り 、 HFCD お よ び HFCD + eLF 群 間 の 遺 伝 子 発 現 デ ー タ の 比 較 を 行 っ た 。
KEGGPathway において、７つのパスウエイに有意な変化が認められ、そのうち、Cho 代
謝に関わるステロイド生合成（ssc00100）パスウエイにも有意な差が認められた。そのパス
ウエイ内で変化した遺伝子を確認したところ、Cho 合成を促進する酵素である NAD(P)
dependet steroid dehydrogenase-like 、 Cytochrome P450, family 51, subfamily A,
polypeptide 1、Squalene epoxidase および Methylsterol monooxygenase 1 の遺伝子発現
が HFCD + eLF 群で有意に増加していた。これらのことから、eLF は、HFCD 誘発性の高
Cho 血症およびアテローム性動脈硬化症の発症を減弱させることを明らかにし、血中 Cho
濃度を低下させることにより、肝臓機能を保護していることが示唆された。
127
謝辞
本研究は、多くの方々のご助力のもと、東京大学大学院 農学生命科学研究科 応用生命
化学専攻 健康栄養機能学社会連携講座 特任教授 加藤久典先生（～2017 年；東京大学総
括プロジェクト機構総括寄付講座「食と生命」 特任教授）及び 同応用生命化学専攻 食
品生化学研究室 教授 佐藤隆一郎先生にご指導を賜り、博士論文として纏めることがで
きました。ここに謝意を述べさせて頂きます。
本研究を推進するにあたり、研究全体を統括して頂いた京都府立医科大学名誉教授 西
野輔翼先生に御礼申し上げます。先生には、ライオン株式会社研究顧問として、当社ライ
フサイエンス分野の研究の方向性設定に際し、親身になってご相談に乗って頂きました。
先生のご助力がなければ、当社の LF 研究のここまでの発展は実現できませんでした。心
より御礼申し上げます。
動物モデルの確立に関しては、北海道大学大学院水産科学研究院 教授 宮下和夫先生、
同教授 細川雅史先生にご指導を頂きました。先生方にご指導頂いたノウハウを元に、栄
養学の専門家である加藤久典先生のご指導の下、検討を進め、モデル確立を達成できまし
た。ここに深く感謝申し上げます。
脂肪肝モデル細胞における検討および DNA マイクロアレイ解析では、東京大学総括プ
ロジェクト機構総括寄付講座「食と生命」 特任教授
加藤久典先生、同講座特任研究員
齋藤憲司先生、中澤京子先生にご指導いただきました。また、受託研究員として、研究室
で一緒に過ごさせて頂いた１年間は、何物にも代えがたい経験となりました。ここに深く
感謝申し上げます。
マイクロミニピッグを用いた検討では、鹿児島大学大学院医歯学総合研究科 先進治療
科学専攻腫瘍学病理学分野
教授 谷本昭英先生、同衛生学・健康増進医学分野 准教授
128
川口博明先生にご指導を賜りました。動脈硬化諸症状を評価することが必須である中、当
社には実験動物として最適なモデルを保有していないことに加え、扱いのノウハウがあり
ませんでした。先生方のご助力・ご指導がなければ、LF の動脈硬化に対する予防効果を
見出すことはできませんでした。ここに深く感謝申し上げます。
更に、本研究に携わる機会を与えて下さり、本研究の遂行に際してご指導を頂きました
立命館大学客員教授（元ライオン株式会社 常務執行役員） 杉山圭吉博士、ライオン株
式会社 研究フェロー（元生命科学研究所長） 村越倫明博士、ウェルネス研究所（元生命
科学研究所 主研） 小野知二博士、また、共同研究者として、実験・解析を共に行った、
管理栄養士（元東京家政大学修士） 富田景子様、ライオン株式会社 薬品第１研究所 鈴
木則行主研、生命科学研究所 鈴木苗穂副主研、生駒（関）桂子副主研、石原康晴研究
員、藤崎（石原）央子研究員、中村啓亮研究員、中村佳菜恵研究員と、その他様々な実験
において、ご協力を頂いた皆様に深く感謝申し上げます。
最後に、私的ではございますが、本研究の遂行および論文の執筆にあたり、支え励まし
てくれた 妻 巧雲、長女
嘉帆、長男 皓世、次女 莉央に心からの感謝の意をここに
記します。
129
...
論文の公開元へ
