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深部生体イメージングを目指したヘム代謝改変による近赤外蛍光タンパク質の高輝度化

小鉢, 健樹 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k24757

2023.03.23

概要

近年、二光子顕微鏡技術の発達によって生きたマウスの組織内で、細胞・分子の動態を
観察することが可能となっている。しかし、一般的な可視光領域の蛍光タンパク質である
緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いた二光子蛍光観察において、多くの組織では 300~500
µm ほどの表層しか観察することができない。これは蛍光観察に用いる励起光が生体内物
質や水分子による吸収・散乱の影響を受けるためである。これらの影響が小さい近赤外領
域の光を用い、より深部の生体組織を観察できることが期待されている。しかし、これま
で多数の近赤外蛍光タンパク質が開発されてきたが、蛍光輝度の低さから依然として生体
イメージングへの応用は限定的であった。本研究では近赤外蛍光タンパク質の 1 つである
iRFP713 に代表されるバクテリアフィトクロム(BphP)由来近赤外蛍光タンパク質の蛍光
輝度を増加させる手法の開発に挑戦した。
GFP などのβ-can 構造を持つ蛍光タンパク質とは異なり、BphP 由来近赤外蛍光タンパ
ク質は発色団として BV を要求する。私は、生体内における iRFP713 の蛍光輝度の低さの
要因として、細胞内の BV 濃度の不足を考えた。哺乳類細胞において BV はヘムの代謝過
程で生成されるが、biliverdin reductase(BVR)によってビリルビン(BR)へ還元される。
そこで細胞内 BV 濃度の上昇を目的として、成体における BVR 産生の主たる遺伝子である
Blvra の遺伝子欠損マウスを作製した。iRFP713 を全身発現するトランスジェニックマウス
との交配と二光子顕微鏡を用いた解析により、肝臓や膵臓をはじめとする様々な組織にお
いて、iRFP713 蛍光輝度が上昇していることを明らかにした。また、Blvra 欠損による BV
上昇のアプローチが、近赤外蛍光カルシウムセンサーNIR-GECO1 の高輝度化、近赤外光
応答性光遺伝学ツール BphP1-PpsR2 の光応答性改善に応用できることを示した。本研究で
作出した Blvra 欠損型マウスの妊孕能、奇形等について検討したところ、明らかな異常は
認められなかった。さらに学習・記憶能力を行動解析により評価したが、野生型との有意
な差は認められなかった。以上の結果により、Blvra 欠損型マウスは近赤外蛍光タンパク質
を用いた生体イメージングや光遺伝学操作において有用なプラットフォームとなることが
示された。 ...

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