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ex vivo器官培養スクリーニングモデルによる、低温刺激における抗がん剤副作用回避メカニズムの解明

田, 甜 TIAN, TIAN テン, テン 九州大学

2022.09.22

概要

がん治療の発展によるがん患者の生存率の向上に伴い、抗がん剤による重篤な副作用が重要な課題となっている。歯、毛、唾液腺および味蕾などの上皮-間葉相互作用により形成される器官は細胞増殖が盛んであることから抗がん剤の影響を受けやすく、歯の形成不全、脱毛、口渇感および味覚異常といった副作用が顕著に生じる。シクロホスファミド(CPA) は小児白血病の治療薬であり、副作用として歯の形成不全が生じることが報告されている。これまでの研究では、胎生マウスの母体に抗がん剤を投与して胎仔の歯胚形成を観察する手法が用いられてきたが、器官における直接的な影響を解析することが困難にあった。本研究では、器官培養法を用いて、CPAの副作用が生じる分子機序を解明し、新たな副作用抑制モデルの構築を行った。
マウス歯胚にCPAを添加し、器官培養法にて培養したところ、形態形成期にあたるE14およびE16の歯胚において、成長の阻害を認めたが、分化期であるE18では、形成阻害は認められなかった。次に免疫組織染色法、TUNEL法およびRT-qPCR法にて解析を行ったところ、CPA添加群の上皮細胞と間葉細胞の両方においてアポトーシスの誘導、細胞の増殖および分化の抑制を認めた。また、共焦点レーザー顕微鏡を用いて三次元的に計測したところ、CPA添加群の歯胚の大きさおよび厚さが有意に減少していた。歯原性上皮幹細胞株M3H1を用いた解析においても同様なアポトーシスの誘導、細胞の増殖・分化抑制を認めた。次に、同モデルを用いて副作用回避法の検索を行った。CPAを添加する最初の3日間のみ25℃の低温刺激下で培養を行った結果、正常な歯胚形成が認められた。毛の器官培養法においても同様の結果を認めた。免疫組織染色法、TUNEL法、MTT法およびRT-qPCR法にて低温培養で形成阻害を回避した歯胚を用いて解析を行ったところ、アポトーシスの誘導は確認されず、細胞増殖および分化はDMSOを添加したコントロール群と有意な差が確認されず、分子レベルにおいても正常に成長していることが認められた。次に、CPAを投与した歯胚の遺伝子発現をCAGE法を用いてトランスクリプトーム解析を行った。CPA添加時に低温培養を行った歯胚において、G1/S細胞周期チェックポイントに関連する遺伝子の発現低下を確認した。M3H1を用いたin vitro解析にて、Rbのリン酸化が低温によって阻害され、G1/S細胞周期チェックポイントであるRポイントを乗り越えられずに、G１期での細胞周期停止が起こることが明らかになった。低温培養による細胞のS期進行阻害とG1期蓄積により、CPAの架橋反応による細胞障害を防ぐことができることを示唆した。これら結果から、CPAは形態形成期歯胚の細胞増殖、分化を抑制しながらアポトーシスを誘導することで形成不全を引き起こすことが明らかになった。また、CPAの臓器形成に与える副作用は、低温に維持することで回避できることが明らかになった。さらに本研究は、抗がん剤の副作用を検出および評価する新たなスクリーニングモデルを構築し、提供するものである。

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