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ミトコンドリアE3ユビキチン複合体を標的とすることで急性骨髄性白血病細胞内因性のベネトクラックス抵抗性を克服する

中尾, 文彦 NAKAO, Fumihiko ナカオ, フミヒコ九州大学

2023.11.30

概要

九州大学学術情報リポジトリ
Kyushu University Institutional Repository

Targeting a mitochondrial E3 ubiquitin ligase
complex to overcome AML cell-intrinsic
Venetoclax resistance
中尾, 文彦

https://hdl.handle.net/2324/7165095
出版情報：Kyushu University, 2023, 博士（医学）, 課程博士
バージョン：
権利関係：Public access to the fulltext file is restricted for unavoidable reason (2)

氏　名：

中尾　文彦

論文名：

Targeting a mitochondrial E3 ubiquitin ligase complex to overcome AML cellintrinsic Venetoclax resistance
（ミトコンドリアE3ユビキチン複合体を標的とすることで急性骨髄性白血病細胞内
因性のベネトクラックス抵抗性を克服する）

区　分：

甲
論　文　内　容　の　要　旨

　Venetoclax（VEN）は BCL2 選択的阻害剤であり、BAX や BH3 only 蛋白と競合的に BCL2 に結合
し、遊離した BAX がミトコンドリア外膜上で重合することでアポトーシスが誘導される。VEN と
Azacitidine または低容量 Cytarabine の併用は急性骨髄性白血病（AML）における重要な治療選択の
一つであるが、VEN 感受性を制御するメカニズムは十分には解明されていない。
　そこで我々は、VEN 感受性を制御する分子・経路を明らかにするため、VEN によるアポトーシスに
抵抗性のマウス AML 細胞株（mMA9Cas）を用いて VEN 存在・非存在下にゲノム網羅的 CRISPR-Cas9
スクリーニングを行ない、ユビキチンE2蛋白をコードする Ube2j2 、 Ube2k 、E3蛋白をコードする
March5 を合成致死遺伝子として同定した。Ube2j2、Ube2k、March5 はユビキチンE3リガーゼ複合体
として協働して VEN 感受性を制御しており、March5 欠損 mMA9Cas では VEN や BCL-XL 阻害剤に対
する感受性が著明に亢進した一方、MCL1 阻害剤に対する感受性には変化がなかった。次に、March5
欠損 mMA9Cas を用いて、VEN 存在・非存在下にゲノム網羅的 CRISPR-Cas9 スクリーニングを行い、
VEN感受性制御に関わる March5 の基質が Noxa であることを同定した。Noxa は Mcl1 と結合してア
ポトーシスを促進することが知られている。March5 欠損による Noxa 蛋白の増加が VEN 感受性を制
御する機構を解明するため、我々は免疫沈降実験を行なった。VEN 治療後、March5 の有無に関わら
ず、Bcl2 から Bax が遊離した。March5 野生型細胞では VEN 治療後の遊離Baxが Mcl1 または BclXL に捕捉された一方、March5 欠損細胞では Mcl1 に結合する Noxa が増加し、VEN 治療下・非治療
下いずれでも Mcl1 と Bax の結合が減少した。Bcl-XL と Noxa の結合は認められず、March5 欠損
細胞においても VEN 治療後に Bcl-XL と Bax の結合は増加した。以上より、March5 は Noxa を介し
て、Mcl1 に捕捉される遊離 Bax量を調整し、VEN 感受性を制御すると考えられた。
　本研究では、AML 細胞において、ユビキチンE3リガーゼ複合体である March5/Ube2j2/Ube2k が VEN
感受性の重要な調整因子であることを同定し、VEN との併用治療の新規治療標的となり得ることを提
案した。

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参考文献

Yamauchi, T. et al. Genome-wide CRISPR-Cas9 Screen Identifies Leukemia-Specific

Dependence on a Pre-mRNA Metabolic Pathway Regulated by DCPS. Cancer Cell 33, 386400 e385 (2018). https://doi.org:10.1016/j.ccell.2018.01.012

Colic, M. et al. Identifying chemogenetic interactions from CRISPR screens with drugZ.

Genome Med 11, 52 (2019). https://doi.org:10.1186/s13073-019-0665-3

Mikhailov, V. et al. Bcl-2 prevents Bax oligomerization in the mitochondrial outer membrane. J

Biol Chem 276, 18361-18374 (2001). https://doi.org:10.1074/jbc.M100655200

Martinez Molina, D. et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the

cellular thermal shift assay. Science 341, 84-87 (2013).

https://doi.org:10.1126/science.1233606

Fig. 1

Venetoclax

(BCL2 inhibitor)

Cas9-expressing MLL::AF9

mouse AML (mMA9Cas) cells

S63845

(MCL1 inhibitor)

FDR<0.1

Trp53

β-score: Venetoclax

Casp9

GeCKO v2

sgRNA library

DMSO

Bcl2

Bax

Bak1

Ube2j2

-2

Bcl2l1

Mcl1

BCL2i or MCL1i

Trp53

Casp9

Bax

Apaf1

Bak1

Apaf1

Pmaip1

β-score: S63845

Ube2k

Pmaip1

Mcl1

Bcl2

Ube2k

-2

Ube2j2

March5

-4

Bcl2l1

7 days

-4

-2

Assess sgRNA

representation

-2

β-score: DMSO

sgRNA

Venetoclax

-4

β-score: DMSO

Ube2j2

empty vector

100

Ube2k

100

March5

100

DMSO

% Crimson

-5

Z-score

Venetoclax

(5 µM)

March5

-10

Ube2k

Ube2j2

-15

Genes

Days

Ube2j2

Ube2k

Annexin V (%)

March5

p<0.0001

Venetoclax(μM)

p<0.0001

Ube2j2 KO

Ube2k KO

β-actin

p<0.0001

C-casp3

p<0.001

Venetoclax(μM)

March5 KO

C-casp3

DMSO

VEN

(5 µM)

VEN

(5 µM)

DMSO

Ube2j2 KO

Empty

100

Ube2k KO

HA-Ube2j2

100

β-actin

VEN

(5 µM)

Empty

100

March5 KO

HA-Ube2k

100

Empty

100

Myc-March5

100

% Kusabira Orange

DMSO

Venetoclax

(5 µM)

Days

Fig. 2

sgRNA-Ube2j2

empty vector

100

% Crimson

March5 KO

sgRNA-Ube2k

empty vector

sgRNA-Ube2j2

sgRNA-Ube2k

100

DMSO

Venetoclax

(3 µM)

Days

March5C65/68S

100

Days

MOM

RING

Venetoclax

(3 µM)

DMSO

Substrate?

100

% Kusabira Orange

March5H43W

March5

empty vector

Ube2j2 / 2k

March5

Fig. 3

Venetoclax

(BCL2 inhibitor)

A-1155463

(BCL-XL inhibitor)

100

Venetoclax

IC50

WT: N/A

#1: 20.8 nM

#2: 22.7 nM

IC50

WT: 4840 nM

#1: 813 nM

#2: 758 nM

March5 KO #1

March5 KO #2

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104

A-1155463

100

% Cell count

100

S63845

(MCL1 inhibitor)

IC50

WT: 10.0 µM

#1: 11.2 µM

#2: 13.1 µM

100 101 102 103 104

100

IC50

NEG: N/A

dTagV-1: 16.5 nM

IC50

NEG: 5210 nM

dTagV-1: 496 nM

100 101 102 103 104

Concentration (nM)

Time (h)

dTagV-1

NEG

Time (h)

dTagV-1

NEG

IC50

NEG: 5650 nM

dTagV-1: 1810 nM

103 104

0 0

10 101 102 103 104

A-1155463 (0.1 µM)

Venetoclax (10 µM)

A-1155463 (0.1 µM)

dTagV-1

NEG

100 101 102

NEG

dTagV-1

Concentration (nM)

Venetoclax (10 µM)

S638845

100

dTagV-1

NEG

Cytosol

Bax

C-casp3

Mitochondria

Gapdh

Cytosol

Cytochrome C

Mitochondria

Venetoclax

% Cell count

Empty vector

IC50

NEG: 8690 nM

dTagV-1: 1720 nM

% Cell count

IC50

NEG:

4290 nM

dTagV-1:

18.6 nM

100 101 102 103 104

% Cell count

100

+Bcl-XL

% Cell count

IC50

NEG: 5080 nM

dTagV-1: 14.2 nM

100 101 102 103 104

IC50

NEG: N/A

dTagV-1: N/A

100 101 102 103 104

IC50

NEG: 6120 nM

dTagV-1:3680 nM

100 101 102 103 104

IC50

NEG: 4610 nM

dTagV-1: 3770 nM

100 101 102 103 104

IC50

NEG: 7780 nM

dTagV-1: 5650 nM

100 101 102 103 104

100

IC50

NEG: N/A

dTagV-1:158 nM

100 101 102 103 104

100

IC50

NEG: 5950 nM

dTagV-1: 4890 nM

100

100 101 102 103 104

100

+Mcl1

S638845

100

dTagV-1-NEG

dTagV-1

100 101 102 103 104

100

+Bcl2

A-1155463

100

IC50

NEG: 4960 nM

dTagV-1: 2540 nM

100 101 102 103 104

100

IC50

NEG: N/A

dTagV-1:5720 nM

100 101 102 103 104

Concentration (nM)

IC50

NEG: 5520 nM

dTagV-1: 2160 nM

0 0

10 101 102 103 104

Fig. 4

March5 KO

March5 KO mMA9Cas

March5

Trp53

FDR<0.05

Ube2j2

Ube2k

March5

M5WT

M5C65/68S

Bax

Apaf1

Noxa

Bak1

Bcl2

Ube2j2

Mcl1

March5

-3

Venetoclax

Ube2k

Bcl-XL

Mcl1

Bcl2l1

7days

-4

-2

Assess sgRNA

representation

Pmaip1

Casp9

Gapdh

β-score: DMSO

Noxa

Cox4

250

Merge

Intensity (a.u.)

200

dTagV-1

-NEG

Noxa

Cox4 (Mitochondria)

DAPI

150

Venetoclax

Intensity (a.u.)

200

150

100

dTag -1

NEG

Time (h) 0

Pmaip1 WT

NEG

IC50

WT: 5970 nM

Pmaip1 KO: 6360 nM

March5 KO: 847 nM

DKO: 2760 nM

IC50

WT: N/A

Pmaip1 KO:

N/A

March5 KO:

33.8 nM

DKO:

2310 nM

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104

Concentration (nM)

A-1155463 (0.1μM)

Pmaip1 KO

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Distance (µm)

Venetoclax (10μM)

Pmaip1 WT

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

250

dTagV-1

A-1155463

100

% Cell count

DMSO

β-score: Venetoclax

Brie

sgRNA library

dTag -1

NEG

0 1

Pmaip1 KO

dTagV-1

NEG

C-casp3

Noxa

HA (March5)

Gapdh

IP: α-Noxa

IP: α-Myc

Input

Noxa

IgG

Input

Myc

IgG

Noxa

MG132 -

March5

Ube2k

Ube2j2

(kDa)

Myc-M5C65/68S

Myc-M5

C65/68S

Noxa

(TUBE pull down)

Noxa (Input)

March5 KO

March5

/Pmaip1 DKO

Fig. 5

IP: anti-Myc (Bcl2)

dTagV-1-NEG

VEN (μM)

IP: anti-Mcl1

dTagV-1

NEG

dTagV-1

IgG 0 0.25 0.5 1.0 5.0 IgG 0 0.25 0.5 1.0 5.0

VEN

IP: anti-Bcl-XL

dTagV-1

NEG

Bax

Myc-Bcl2

Noxa

Mcl1

IP: anti-Bax

dTagV-1-NEG

VEN (μM) IgG

Bcl-XL

dTagV-1

0.5 1.0 5.0

IgG 0

0.5 1.0 5.0

Myc-Bcl2

Bax

BAX BAX

MCL1

BAX

MCL1

BAK

BCL2

Venetoclax

MCL1

BAK No

Noxa

Nox

MCL1

BAX

BCL2

MCL1

BCLXL BCLXL

BAX

MCL1

BCLXL BCLXL

BAK

BAX

BCL2

Noxa

BCL2

BAX

BCL2

BAX

BCLXL BCLXL

BAX

-intact

BAX

BCL2

BAX

Nox

MARCH5

BCL2

BAX

BAX BAX

BCLXL BCLXL

BAK

BAX

MCL1 MCL1 MCL1

BAX

BAK

MCL1

BAX MCL1 MCL1 MCL1

BAX

BAK

BAX

Cell survival

BAX BAX

MARCH5

-depleted

BCL2

BAX

BCL2

BAX

BCL2

BAX

BCL2

BAX

BAX BAX

BAX

BCLXL BCLXL

BAX

BCL2

BCLXL BCLXL

BAK

BAX

BCL2

BAX

BCLXL BCLXL

BAX

BCLXL BCLXL

BAK

BAX

Venetoclax

MCL1

BAX

MCL1

Noxa

MCL1

Noxa

MCL1

BAX

MCL1

Noxa

MCL1

BAK

MCL1

BAK

MCL1

Noxa

MCL1

BAX

MCL1

Noxa

MCL1

Noxa

MCL1

BAX

MCL1

Noxa

MCL1

BAK

MCL1

BAK

MCL1

Noxa

BAX

Apoptosis

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分野

大学

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言語

ミトコンドリアE3ユビキチン複合体を標的とすることで急性骨髄性白血病細胞内因性のベネトクラックス抵抗性を克服する

概要

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関連論文

DIF-1はS6Kを介したSTAT3の翻訳抑制によってcyclin D1の発現を減弱し、MCF-7細胞の増殖を抑制する

Glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondrialを介したリゾホスファチジン酸合成は急性骨髄性白血病のミトコンドリアダイナミクスを制御する

The Parkinson’s Disease-Associated Protein Kinase LRRK2 Modulates Notch Signaling through the Endosomal Pathway

Staurosporine and venetoclax induce the caspase-dependent proteolysis of MEF2D-fusion proteins and apoptosis in MEF2D-fusion (+) ALL cells

Gab1 in livers with persistent hepatocyte apoptosis has an antiapoptotic effect and reduces chronic liver injury, fibrosis and tumorigenesis.

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