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Genetic analysis of intracellular distribution and morphology of mitochondria in C. elegans

Obinata Hiroyuki 東北大学

2022.03.25

概要

【はじめに】
細胞のエネルギー生産の主たる場であるミトコンドリアは、細胞内のエネルギー需要に合わせて絶えずその分布や局在を変えている。正常細胞のミトコンドリアは常に分裂・融合を繰り返しており、このような形態変化はミトコンドリア動態と呼ばれる。興味深いことに、ミトコンドリア動態の破綻はミトコンドリアの細胞内分布の異常や輸送の低下を引き起こすが、その詳しいメカニズムには不明な点が多く残る。そこで本研究では、線虫C.elegansをモデルにミトコンドリアの細胞内分布と動態の関連性の解明を目指した。

【結果・考察】
第1章抗生物質Nourseothricinとその耐性遺伝子Sat2の線虫C.elegansにおけるゲノム編集技術への応用、並びに神経内ミトコンドリアの解析株の樹立
本研究では、まだ線虫で利用実績の無かった抗生物質Nourseothricin(NTC)とその耐性遺伝子Sat2をC.elegansの形質転換法への応用し、意図した神経特異的にミトコンドリアを可視化する手法を確立した。NTC含有プレート上では野生株の生育が抑制される一方、Sat2を多コピー保有する線虫は正常に生育した。このNTC耐性能はSat2のコピー数によらず、CRISPR/Cas9法を用いたゲノム上への1コピーの挿入でも効果を示した。このNTC-Sat2系を利用し、DA9ニューロンとURXニューロンそれぞれで特異的にミトコンドリアを可視化した株の作製に成功した。作製した株は第2章・第1節で解析に用いた。

第2章線虫C.elegansを用いたミトコンドリアの細胞内分布と形態の遺伝学的解析
第1節線虫slc-25A46遺伝子の分子遺伝学的解析
slc-25A46遺伝子は、樹状突起内のミトコンドリアの大きさと分布数が減少する線虫変異体の原因遺伝子として所属研究室で同定された。先行研究からslc-25A46はミトコンドリア動態に関与することが示唆されていたため、slc-25A46変異体の解析を通しミトコンドリア動態と細胞内分布の関連性の解明を試みた。

①slc-25A46のnull変異体ではミトコンドリアが小さく断片化することから、線虫slc-25A46はミトコンドリア動態の中でも『融合』に働く因子であることが示された。また、同じ融合因子であるFZO-1をslc-25A46のnull変異体に付加発現させるとミトコンドリアの大きさが野生型と同程度まで回復した。一方で、SLC25A46をfzo-1のnull変異体に付加発現させても大きさは回復しなかった。このことから、ミトコンドリア融合において、遺伝学的にslc-25A46はfzo-1の上流であることが示唆された。

②slc-25A46のnull変異体では、樹状突起内のミトコンドリア数が減少している。この表現型はFZO-1を付加発現させることで野生型と同程度まで回復した。同様に、fzo-1のnull変異体では、樹状突起内のミトコンドリア数は減少しており、この表現型はSLC-25A46の付加発現で野生型と同程度まで回復した。このことから、樹状突起内のミトコンドリアの分配においては、slc-25A46とfzo-1に遺伝学的な上下関係は見られず、独立、もしくは協調的に働くことが示唆された。

③ヒトSLC25A46で神経変性疾患の原因として報告されている6つのアミノ酸変異を、CRISPR/Cas9法を用いて線虫slc-25A46に導入した。その内、306番目のアルギニンのシステインへの変異体(slc-25A46[R306C])で最も顕著にミトコンドリアの断片化が観察された。つぎに、神経変性研究のモデルとして使用頻度の高い線虫PVDニューロンを用いて、slc-25A46の変異が神経の形態に与える影響を解析した。その結果、slc-25A46null変異体、slc-25A46[R306C]変異体の両方で、異所的な神経突起の増加や、本来加齢に伴い増加するビーズ状構造の若齢期からの蓄積など、神経変性の表現型が観察された。線虫の解析から、ヒトSLC25A46に変異を持つ患者の神経細胞でも、ミトコンドリアの断片化や突起内のミトコンドリア数の低下が起きている可能性がある。遺伝学的なツールが豊富で解析が行いやすい線虫で研究を進めることで、ミトコンドリア病に対する医学的な病態の理解、治療法確立に向けたターゲット因子の探索のスピードを速めることができると期待される。

第2節グリア細胞をモデルとした、ミトコンドリアの形態異常を引き起こす新規線虫変異体の取得
SheathグリアはC.elegansにおけるグリア細胞の一種で、感覚繊毛の構造や機能の維持に重要な役割を果たしている。本研究ではSheathグリアの細長い細胞形状に着目した。グリア細胞には神経細胞でいう樹状突起や軸索のような区分けはないが、核の近傍で合成されたタンパク質やオルガネラは突起の末端まで輸送・分配される必要があると考えられ、その細胞特性の違いから、神経細胞とは異なる制御メカニズムが存在する可能性がある。所属研究室で樹立されたAMsh(頭部Sheathグリア)とPHsh(尾部Sheathグリア)でミトコンドリアが可視化された株を用いて、Sheathグリアにおけるミトコンドリアの形態と分布を観察した。

①slc-25A46変異体とfzo-1変異体を観察したところ、突起内のミトコンドリア分布に低下は見られなかった。一方、ミトコンドリアとモータータンパク質のアダプターとして働くtrak-1の変異体では、突起内のミトコンドリアが顕著に減少した。よってAMphグリアでは、神経細胞でみられたようなSLC-25A46やFZO-1を介した経路ではない、別のミトコンドリアの分布・輸送メカニズムが支配的であることが示唆された。新たな細胞内輸送のモデルとして、神経細胞では困難なオルガネラの配置や局在の研究への利用可能性が示された。

②EMSを⽤いて変異体スクリーニングを⾏い、グリア細胞でミトコンドリアが断⽚化している変異体を新たに4つ取得した。そのうち2つの変異体では、ミトコンドリアの断⽚化の他にPHshグリアの突起形状に異常がみられた。マッピングの結果、いずれの変異体も、第1節で扱ったミトコンドリア融合因子とは異なる遺伝⼦に変異が⼊っていた。今後、これらの変異体を解析することで新たなミトコンドリアの動態関連遺伝⼦の発⾒とその機能の解明が期待される。

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