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腎障害に関連する腸内細菌叢由来代謝物を標的とした分析手法構築と応用

金光 祥臣 東北大学

2020.09.02

概要

ヒトの腸管内には、100 兆個にも及ぶ細菌が 「腸内細菌叢」 として存在し、それらは、腸内で多様な代謝物を産生する 1,2。近年、次世代シーケンサーやメタボローム研究の普及により、血中に存在する全代謝物の 10%以上が、生体内濃度に腸内細菌叢の影響を受けることが明らかにされた 3。代謝物は、主として全身循環から腎臓へと流れ込んだ後、不要なものが尿として体外へ排出される。したがって、慢性腎臓病 (chronic kidney disease, CKD)* などの腎障害は、宿主の異化・同化産物の排泄障害に止まらず、腸内細菌叢が関与する様々な代謝物恒常性の破堤に繋がる。腸内細菌叢が産生する代謝物の中には、病原体に対するバリア機能、腸管上皮の分化誘導、宿主免疫システムの維持などの生理機能を担うものが見出され、その分子作用機構の解明が急速に進んでいる 4。その結果、肥満、糖尿病、動脈硬化、発がん、及び自閉症などの腸疾患以外の全身性病態に対する腸内細菌叢の関与が、知られてきた 5。特に CKD においては、腸と腎臓が炎症反応、免疫機序などを介して相互に病態へ影響を及ぼし合うという 「腸腎連関」 の概念が、提唱されつつある 6。この概念の鍵となるものが、正常な腎機能であれば体外へ排泄されるはずの有毒な代謝物――尿毒症物質 (uremic toxins, UTx) である 7–12。UTx は、欧州の専門委員会 (European Work Group on Uremic toxins) によって水溶性低分子、水溶性中分子、蛋白結合型に分類され 13,14、2019 年現在では、 130 以上の物質が定義されている。このうち、水溶性低分子に属するトリメチルアミン- N-オキシド (trimethylamine N-oxide, TMAO) は、その血中濃度と CKD 患者の腎機能が強く負に相関し、さらに全身性炎症や動脈硬化の促進、及び心血管病(cardiovascular disease, CVD) 発症率と死亡率の予測因子となり得る 15–17。また、蛋白結合型であるインドキシル硫酸 (indoxyl sulfate, InS) と p-クレジル硫酸 (p- cresyl sulfate, pCS) は、CKD の病態進行を反映するバイオマーカーとしての役割に加え 18、その高い血中濃度は、死亡率に関連する 19–21。興味深いことに、TMAO、 InS、及び pCS は、それぞれ食事由来のホスファチジルコリン (又はコリンや L-カルニチン)、トリプトファン、及びチロシンを原料として、腸内細菌叢による代謝を経て生成 される UTx である 3,22–24 (Fig. 1)。また、宿主の食事の質や量、抗菌薬の服用によって、これらの血中濃度が変動することも明らかにされた 24,25。すなわち、腸内細菌叢と UTx が、CKD と食習慣、CVD 及び全身性疾患をつなぐメカニズムに深く関与する。

一方で、ある種の腸内細菌叢が産生する水酸化脂肪酸やオキソ脂肪酸 26,27、短鎖脂肪酸 † (short-chain fatty acid, SCFA) 28–30、D-アミノ酸 31、5-メチルトリプトファンなどは 32、抗炎症作用や腸管免疫の制御を介した腎保護的な側面も有する。しかし、CKD 患者では、健常者と比べて腸内細菌叢の多様性が減少するため33,34、これらの生体内濃度は、UTx と反して減少する。さらに、InS や pCS の前駆体となるインドールや p-クレゾールなどを産生する悪性の菌体が増加し、SCFA を産生する良性の菌体が減少する 35。このような腸内細菌叢の乱れは、ディスバイオーシスと呼ばれ、腸管上皮のタイトジャンクションに関与するタンパク質の発現を低下させる要因となる。その結果、腸管透過性の亢進をきたし、UTx と菌体が、全身循環に侵入し易くなるため、慢性炎症が惹起される34,36–38。CKD によってディスバイオーシスが生じる機序は、一元的ではなく、合併する代謝性アシドーシスや虚血や浮腫による腸管機能の低下のほか、UTx の関与が考えられている 37。したがって、CKD の病態と腸内細菌叢の状態は、相互に影響し合い、UTx の蓄積や炎症反応の助長を介して、腎機能とディスバイオーシスをさらに悪化させる、負の循環が存在する 37,39 (Fig. 2)。

ここで、正常な腸内細菌叢が担う、宿主の脂肪酸やアミノ酸、胆汁酸代謝に対する寄与に顧みると 40,41、ディスバイオーシスは、さらに多様な代謝物変化を介した、CKD全身病態への関与が想定できる。これまでに、筆者らの研究グループは、腸内細菌叢が、尿毒症物質の産生と CKD 病態に与える影響を調べるため、無菌環境 (germ- free, GF) 下で飼育したアデニン食誘発性の慢性腎臓病モデル (renal failure, RF) マウス (以下、GF-RF マウスと称す) に対するメタボローム解析を実施した 42。その結果、腎障害時の血中代謝物プロファイルにも大きな違いを及ぼすこと、そして InS、 pCS、 TMAO などを含む 11 種が、腎機能と腸内細菌叢の影響を大きく受ける 「腸内細菌叢由来 UTx」 であることを明らかにした 42。しかし、これら個々の詳細な生理機能や CKD 全身病態との係り、腎障害との時空間的関連性については、未解明なものも多い。したがって、筆者は、その量的及び質的変動を詳細に捉えるこ とが、 「腸腎連関」 を紐解く上で重要な意味を成すと考えた。近年、UTx などの代謝物分析 は 、 液 体 ク ロ マトグ ラ フ ィ ー / タ ン デム 質 量分 析法 (liquid chromatography/tandem mass spectrometry, LC-MS/MS) が主流であるが 43–45、最新機器を駆使しても、感度、定量性、汎用性、利便性、網羅性などの分析化学的特性を全て兼ね備えた測定系の構築は、困難である。特に、LC 分離や MS のイオン化に付随する網羅性や定量性の問題により、研究目的や用途に応じた分析系を考えなければならない。例えば、生体中の UTx 濃度と腎機能の相関解析には、健常者検体を定量できる感度、多様な試料に適応できる堅牢性、及び精密な定量性を重視 した絶対定量系が必要となる。また、膨大な腸内細菌叢関連代謝物から有意性のある分子の探索には、網羅性と簡便性を両立させた分析系が求められる。しかし一方で、有意な分子を見出した後に、バイオマーカーとして臨床実用するためには、簡便かつ汎用性に優れる免疫学的手法が、LC-MS/MS よりも有用となる。

そこで、本研究では、腎障害に関連する腸内細菌叢由来代謝物を主たる標的として、定量精度に特化した絶対定量法、臨床利用に適する免疫学的手法、及び網羅性を重視した相対定量手法、それぞれ 3 つの分析手法の構築を行った (Fig. 3)。各分析手法に係る課題を独自の技術によって解決し、新規定量系を構築できれば、「腸腎連関」 に対する理解を推し進めるだけでなく、臨床バイオマーカー、新規治療標的の発見、さらには分析化学研究の発展にも結び付く。

まず、本研究の第 1 章では、CKD 病態との関連性が示唆されている腸内細菌叢由来 UTx を標的とした、LC-MS/MS を用いる高感度かつ信頼性の高い一斉定量系の構築に挑んだ。単一固定相を用いたクロマトグラフィー分析に係る分離分析の課題を解決する手段として、ミックスドモードクロマトグラフィー技術を利用し、MS 及び LC 条件を精査して最適化するとともに、分析法バリデーションを実施したことを述べる。また、 CKD 患者の腎機能と血清中の UTx 濃度との相関を解析した。

第 1 章にて構築した定量系を、糖尿病性腎臓病患者に対するコホート研究検体へ適用した結果、蛋白結合型 UTx であるフェニル硫酸 (phenyl sulfate, PS) が、糖尿病性腎臓病の病因及び予後予測マーカーであること、並びに PS の血中濃度の制御が、腎障害の新規治療法に繋がる可能性も見出した 46。したがって、今後の腎疾患治療においては、臨床にて血中 PS 濃度を簡便かつ継続的に観察できる汎用性の高い定量法が求められる。しかし、地域医療施設を含む臨床現場において、LC- MS による PS 測定は、価格や汎用性などの点で容易ではない。故に、第 2 章では、抗 PS モノクローナル抗体の作製と Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) による血液中濃度定量手法の構築を行った。各節において、より特異性の高い抗体を得るためのハプテンのデザイン、PS 類似体を用いた構造特異性の検証、及びヒト血清試料に対する ELISA の測定条件を精査したことを述べる。また、第 1 章で明らかにした CKD 患者血清中の PS 濃度を基にして、構築した ELISA の定量精度を検証した。

第 1 章及び第 2 章の研究を通じて、PS のような腸内細菌叢由来 UTx が、腎疾患病態に深く関わることを明らかにした一方で、筆者らは、GF-RF マウスが、腸内細菌叢由来 UTx の血中濃度が低下しているにも関わらず、通常の飼育環境 (specific pathogen free, SPF) 下で腎障害を呈したマウス (以下、 SPF-RF マウスと称す) よりも腎機能障害が悪化しやすい、という逆説的な結果も得ていた 42。Jangらも、腎虚血再灌流による腎障害モデルにおいて、GF マウスが SPF マウスよりも腎機能が増悪するという同様の結果を報告している47。しかしながら、他の腎障害モデルでは、抗菌薬による腸管内の除菌を施すと、腎障害に起因する炎症物質の生成が抑えられ、腎組織障害の軽減効果があるという逆の結果も報告されている 48,49。これらの所見は、腸内細菌叢が関連する代謝物が、宿主の腎機能に対して、増悪と保護の多彩な作用を有することを強く裏付けている。ここで筆者は、胆汁酸や馬尿酸、SCFAなどの、その化学構造中にカルボキシル基を持つ代謝物の生体内濃度が、GF-RFマウスにおいては顕著に抑制されることに注目した 42。すなわち、腸内細菌叢が代謝に関与するカルボキシル基含有代謝産物が、病態に対して重要な生理機能を担う可能性があり、この仮説の検証には、生体中に存在するカルボキシル基含有代謝物の量的変動を精査する分析手法が必要であった。

そこで、第 3 章では、腸内細菌叢が、その産生に深く関与し、多彩な生理作用を有するカルボキシル基含有代謝物の包括的な相対定量手法の構築に挑んだ。より簡便、安価、迅速な方法を目指し、2-ピコリルアミン (2-picolylamine, 2PA) 安定同位体を用いる化学的同位体標識 (chemical isotope labeling, CIL)-LC-MS/MS を開発した。各節では、2-PA 安定同位体の合成法及び分析条件の精査結果と、定量精度、真度についての検証結果を述べる。さらに、GF-RF マウスと SPF-RF マウス間の胆汁酸や脂肪酸などの血中及び腸内量を比較解析し、腸内細菌叢が関わるカルボキシル基含有代謝物が、CKD 病態にもたらす役割について推察した。

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