Actin crosslinking by α-actinin averts viscous dissipation of myosin force transmission in stress fibers

概要

主論文の要旨

Actin crosslinking by α-actinin averts viscous
dissipation of myosin force transmission in stress fibers
ストレスファイバーにおけるアクチン線維間の
α-アクチニンによる架橋はミオシン収縮力の
伝達過程で生じる粘性散逸を抑制する

名古屋⼤学⼤学院医学系研究科
機能形態学講座

総合医学専攻

細胞⽣物学分野

(指導：宮⽥ 卓樹
勝⽥ 紘基

教授)

【緒言】
ストレスファイバー(Stress Fiber, 以下 SF)はアクチン線維及びミオシン、アクチン
結合タンパク質から構成され、細胞の形態維持や遊走、分化、細胞分裂などにおいて
重要な収縮力を生み出している。SF 内のミオシンによる収縮力は SF 端部の接着斑を
介して細胞外マトリクスに伝達される。このとき発生する SF の基質に対する牽引力
は細胞の接着力を強化するとともに、基質の硬度などの細胞外の機械的特性の感知(メ
カノセンシング)に寄与している。感知された基質の機械的特性は細胞の遊走や分化
に影響を与えることが既に報告されている。SF は粘性、弾性双方の機械的性質を有す
るが、粘弾性がミオシンの収縮力の伝達効率にどのように関与し、細胞のメカノセン
シングなどの細胞機能に寄与しているかは明らかになっていない。本研究ではアクチ
ン架橋タンパク質の一つである α-アクチニンによる架橋が SF の物性と力伝達に与え
る影響を解析した。併せて SF の物性変化が細胞の遊走に及ぼす影響についても検討
した。
【方法】
マウス筋芽細胞株 C2C12 細胞に shRNA を導入し、α-アクチニンをノックダウンし
た細胞株(以下 α-アクチニン KD 細胞)と non-target control 細胞株(以下 non-target 細
胞)を樹立した。SF のダイナミクスを観察するため、アクチン線維に結合する LifeActmCherry やミオシンと GFP のキメラである MYHIIA-GFP を細胞内に導入し、タイム
ラプス観察を行った。また、原子間力顕微鏡(Atomic Force Microscopy, AFM)を用いて
SF の弾性を測定した。細胞が細胞外基質に及ぼす力は牽引力顕微鏡法(Traction Force
Microscopy, TFM)により、細胞外基質の変位を計測することで測定した。以上の培養
細胞実験で得られた結果をもとに α-アクチニンを模した架橋とミオシンを模した収縮
力を取り入れ、SF を短いアクチン線維の集合体として表現した SF の 1 次元計算モデ
ルを作成し、シミュレーション実験を行って実験結果との整合性を検討した。
さらに α-アクチニン KD 細胞における SF の維持機構を蛍光標識アクチンの取り込
み や ア ク チ ン 分 子 の 光 褪 色 後 蛍 光 回 復 (Fluorescence Recovery After Photobleaching,
FRAP)を用いて解析した。最後に α-アクチニンの細胞機能における役割を検討するた
めに、細胞遊走に対する α-アクチニンノックダウンの影響を調べた。
【結果】
定量 PCR と Western blotting により α-アクチニンの発現量低下を確認した α-アクチ
ニン KD 細胞でタイムラプス観察を行い、SF のダイナミクスへの影響を調べた。α-ア
クチニン KD 細胞では non-target 細胞と比較してアクチン線維とミオシンの SF に沿っ
た顕著な流れが観察され(図 1A)、両者の SF に沿った移動速度が有意に上昇していた
(図 1B-D)。α-アクチニンを介したアクチン線維の架橋が SF に沿ったアクチン線維の
移動速度に与える影響を調べるため、α-アクチニンからアクチン結合部分を欠損させ、
アクチン線維を架橋できない dominant-negative 変異体を導入した。dominant-negative

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変異体の発現量が多く、アクチン線維間の架橋がより強く阻害されている細胞ほどア
クチン線維の流動速度が大きかったことから(図 1E)、架橋密度の低下により SF のア
クチン線維が流動化することが示唆された。SF の弾性を AFM によって測定したとこ
ろ、α-アクチニン KD 細胞では SF の流動化とともに SF の弾性が低下していることも
分かった(図 2A, B)。
次に SF の流動化がミオシンの力の伝達に及ぼす影響を調べるため、細胞外基質に
牽引力として伝わる力を TFM により測定した。その結果、細胞外基質に対する牽引力
は non-target 細胞と比較して α-アクチニン KD 細胞で有意に低下していた(図 3A, B)。
このとき、α-アクチニン KD によってミオシンの活性(収縮力)は低下していなかった。
ミオシン軽鎖の脱リン酸化を薬理学的に阻害することでミオシンによる収縮力発生を
高めると、non-target 細胞では細胞外に加えられた牽引力が増大したが、α-アクチニン
KD 細胞では有意な変化が生じなかった(図 3C)。これらの実験結果から α-アクチニン
の発現量が低下した SF ではミオシンの発生する力を接着斑に効率的に伝達できなく
なることが示唆された。α-アクチニン KD 細胞における SF の流動化や収縮力の伝達効
率への影響がアクチン線維の架橋密度の変化で生じうるか否かを物性学的に検討する
ために、SF を模した短いアクチン線維の集合体が α-アクチニン、ミオシンそれぞれに
相当する架橋で結合された計算モデルを作製した。α-アクチニンの架橋は結合、解離
時に摩擦が発生し、ミオシンの架橋は収縮力を発生すると仮定した。本計算モデルに
よるシミュレーションにおいても実験結果と同様、アクチン線維間の架橋が少ないほ
ど、SF の流動性が大きくなり(図 1H)、端部に加わる力が小さくなること(図 3D)が示
された。
α-アクチニン KD 細胞において SF の流動化により構成タンパク質の流動速度が上
昇していたが、SF は切断、崩壊することなく構造が維持されていた(図 1A)。そこで
SF の生成速度が変化している可能性を考え、α-アクチニン KD 細胞における SF の構
造維持機構を調べた。アクチン重合部位の分布を、蛍光標識したアクチンの取り込み
により観察した(図 4A, B)。その結果、non-target 細胞では SF 端部の接着斑近傍に限
局した蛍光標識アクチンの取り込みが見られた。一方、α-アクチニン KD 細胞では SF
全体に蛍光標識アクチンが取り込まれていた。FRAP 実験において、α-アクチニン KD
細胞では退色後の蛍光強度がより大きく回復しており、より多くの SF 内のアクチン
分子が重合・脱重合に関与していることが示唆された(図 4C, D)。すなわち α-アクチ
ニン KD 細胞では SF の全長にわたってアクチン分子の重合、脱重合が促進されるこ
とで SF の構造が維持されている可能性が示唆された。
細胞レベルで細胞内外の機械的環境の影響を受ける細胞機能の 1 つに細胞遊走が挙
げられる。先行研究で細胞の遊走速度が基質の硬度依存的に変化することが報告され
ている。そこで α-アクチニンの発現抑制が基質硬度依存的な細胞遊走に及ぼす影響を
タイムラプス観察により解析した。その結果、α-アクチニン KD 細胞では基質の硬さ
に応じた細胞の遊走速度の変化率(基質硬度に対する感受性)が低下していることを明
らかにした(図 5A, B)。

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【考察】
タイムラプスイメージングおよび TFM の結果から、α-アクチニンによるアクチン線
維の架橋が減少するとミオシン収縮力の伝達効率が低下することが明らかになった。
さらに計算機シミュレーションの結果から、架橋密度の低下によるアクチン線維の流
動化によって、速度依存的な粘性摩擦によるエネルギー損失が増大し(粘性散逸)、そ
の分だけミオシンの収縮エネルギーが失われることが収縮力の伝達効率の低下の原因
であると考えられた。先行研究において、アクチンとの結合がより安定化する α-アク
チニンの変異体を導入した細胞では、細胞内の弾性が大きくなるという結果が示され
ている。本研究の結果はこの先行研究と一致しているのみならず、SF の物性が細胞内
での収縮力伝達を調節する仕組みをより詳細に明らかにした。さらに細胞外基質の硬
度に応じた遊走速度変化が α-アクチニン発現量低下に伴い減弱していたことから、αアクチニンが基質の硬度感知や基質の硬度に対する応答に関与している可能性が示唆
された。本研究の成果は SF やアクチン線維のメカニクスを標的とする、創傷治癒の
促進などの新しい治療法の開発に寄与することが期待される。
【結論】
本研究はアクチン線維間を架橋する α-アクチニンは SF の粘弾性の構成要素であり、
α-アクチニンの発現量低下は弾性の低下のみではなく、粘性の低下とそれによる SF の
流動性を促進することで粘性散逸の増大を招き、ミオシン収縮力の伝達を減弱する可
能性を示した。さらに SF の物性が細胞の基質硬度の感知や遊走などの細胞機能に関
与することを示した。

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図 1 SFs are fluidized by inhibiting α-actinin crosslinks.
(A) Time-lapse images of LifeAct-mCherry in non-target (control) and α-actinin KD cells. Elapsed time is shown as
h:min. Scale bars; 10 μm.
(B) Representative time-lapse fluorescence images and kymographs of myosin IIA-GFP on SFs in α-actinin KD and
non-target cells. Scale bars of distance; 3 μm. Scale bars of time in kymographs; 5 min.
(C) (D) Velocities of myosin IIA-GFP (C) and LifeAct-mCherry (D) along SFs in non-target and α-actinin KD cells.
The velocity was quantified from time lapse measurements longer than 5 min. Horizontal bars represent
means. ****p < 0.0001; Welch’s t-test (N = 30-35 SFs in 10-12 cells).
(E) The velocity of LifeAct-mCherry along SFs was plotted against the fluorescence intensity of GFP for each cell
expressing ΔABD-GFP (a GFP-tagged, deleted form of α-actinin lacking the actin binding domain) (N = 31 cells)
or GFP (N = 22 cells). The velocity value of each dot represents the averaged velocity of LifeAct-mCherry along
2
3 SFs. Regression lines of linear fitting and Spearman’s correlation coefficients (R ) are also shown.
(F) Averaged maximum velocity of actin filaments along a SF is plotted against the α-actinin concentration in the SF
under different myosin II concentrations.

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図 2 Fluidized SFs are less elastic.
(A) Phase contrast images of non-target and α-actinin KD cells, and elastic modulus maps of the boxed regions in the
phase contrast images. The elastic modulus at each point in 20 μm × 20 μm area (128 × 128 points) was derived
from a force-indentation curve obtained at that point. Scale bars in phase contrast images; 20 μm.
(B) Elastic moduli of SFs in α-actinin KD cells and non-target (control) cells. Horizontal bars represent means.
****p < 0.0001; unpaired Student’s t-test (N = 30 cells).

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図 3 Myosin II-generated force is dissipated in fluidized SFs.
(A) Phase contrast (upper panels) and traction stress (lower panels) images of α-actinin KD and non-target C2C12
cells on fibronectin-coated 16.3 kPa polyacrylamide gel substrates. Yellow lines indicate outlines of cells. The
heatmap scale of traction stress is common between non-target and α-actinin KD cells. Scale bars; 10 μm.
(B) Traction stress exerted by non-target (N = 25) and α-actinin KD (N = 22) cells. Horizontal bars represent means.
**p < 0.01; unpaired Student’s t-test.
(C) Traction stress exerted by α-actinin KD and non-target cells treated with either calyculin A (1 nM) or vehicle
(DMSO). Traction stress was measured 10 min after calyculin A or DMSO was added. Horizontal bars represent
means. n.s. no significant difference, **p< 0.01; unpaired Student’s t-test (N = 24-28 cells each).
(D) Traction force acting on FAs at the ends of a SF was simulated in our mathematical model and plotted against the
α-actinin concentration in the SF under different myosin II concentrations.

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図 4 Actin turnover is accelerated in fluidized SFs.
(A) Non-target (control) and α-actinin KD C2C12 cells were stained for vinculin and F-actin (with phalloidin) after
rhodamine-actin incorporation in the actin polymerization assay. Scale bars; 10 μm.
(B) Line profiles of fluorescence intensities of vinculin (black) and rhodamine-actin (red) along SFs in non-target
(control) and α-actinin KD cells. The left and right scales are for vinculin and rhodamine-actin intensities,
respectively. Fluorescence intensities were measured along SFs indicated by yellow lines in the inset images of
rhodamine-actin. Arrows show high fluorescence intensities of vinculin at FAs.
(C) Time-dependent changes of fluorescence intensities of GFP-actin in photobleached regions on SFs in non-target
(black) and α-actinin KD (red) cells. Data are shown as mean ± SEM. Regression curves fitted with FRAP fitting
equation are also shown. (N = 40 SFs from 15-17 cells).
(D) Mobile fraction of GFP-actin FRAP on SFs in non-target and α-actinin KD cells. Horizontal bars represent means.
n.s. no significant difference, **p< 0.01; unpaired Student’s t-test (N = 38-40 SFs from 15-17 cells).

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図 5 Role of α-actinin in rigidity-dependent regulation of cell migration speed.
(A) Rose plots depicting migration trajectories of individual non-target and α-actinin KD cells for 240 min on
fibronectin-coated glass (upper panels) or 2.3 kPa polyacrylamide gel (lower panels) substrates (N = 31-34 cells).
Magnified views of the cell trajectories on glass are also shown.
(B) The migration velocity of non-target and α-actinin KD cells on fibronectin-coated glass and 2.3 kPa
polyacrylamide gel substrates. Horizontal bars represent means. **p< 0.01, ****p< 0.0001; Welch’s t-test
(N = 31-38 cells).

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