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Gタンパク質によるファミリー選択的なGタンパク質共役型内向き整流性カリウムイオンチャネル活性制御機構の解明

加納, 花穂 東京大学 DOI:10.15083/0002003298

2022.03.09

概要

【背景】
　Gタンパク質共役型内向き整流性カリウムイオンチャネル(GIRK)は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)に共役して開口することで心拍数の低下や抑制性神経伝達を担う。GPCRへのリガンド結合に伴い、Gタンパク質(Gαβγ)が活性化されてGαとGβγに解離すると、GβγがGIRK細胞内領域に結合しGIRKの開口が誘起される。生理的条件下でGIRKは、M2アセチルコリン受容体などのGPCRを介した抑制性神経伝達物質刺激に応じて数百ミリ秒～1秒程度で迅速に開口するが、βアドレナリン受容体のような興奮性神経伝達を司るGPCRへの刺激では開口しない(図1)。このような細胞外刺激の種類に応じた選択的かつ効率的なGIRKの開口は、シグナル伝達経路の混線を防ぎ適切な細胞応答を維持する上で必要である。GIRK開口因子であるGβγは、いずれのGPCR刺激で解離したものも同等である。それにもかかわらず特定の刺激に選択的にGIRKが応答する分子機構として、Gタンパク質の中でもi/oファミリーのGα(Gαi/o)から解離したGβγのみがGIRKを開口させることが報告されている。先行研究のFRET実験などから、GIRKとGαi/oβγが不活性化状態において複合体を形成し共局在することで、活性化時のGαi/o選択性を決定していると提唱されているものの、それらの蛍光タンパク質融合体を用いた実験では高分解能の構造情報は得られない。そのため、複合体の形成がGαi/o選択的に生じる要因や、複合体の状態からGIRKが迅速に開口する構造機構は不明であった。さらに、このような膜上の複合体は、可溶化すると見かけの親和性が低下するため、単離して構造解析を行うことが困難であった。
　そこで本研究では、膜環境を再現して低親和性の相互作用を解析可能な溶液NMR法を用いて、GIRK-Gαi/oβγ複合体の構造を明らかにし、Gαi/o選択性を担う構造的要因を同定することで、Gαi/o選択的にGIRKの活性が制御される機構を解明することを目指した。

【方法と結果】
1. GαのヘリカルドメインがGβγによるGIRK開口のファミリー選択性を決定する
　GIRKの開口におけるGα選択性を評価し、Gαのどの部位が選択性を決定するかを同定するため、生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)を利用した実験系を構築した。HEK293T細胞にGPCR,Gα,蛍光タンパク質を融合させたGβγ,ルシフェラーゼを融合させたGIRKを発現させた。GPCRのアゴニストを添加し、Gタンパク質が活性化したときのGβγ-GIRKの結合をBRETの変化から検出した。Gタンパク質の活性化度合を評価するコントロール実験も行い、GIRK-Gβγの結合をGタンパク質の活性化度合で規格化した値(specificityfactor)を各種Gαで比較した。
　その結果、i/oファミリーに属するGαi3と比べて、Gαi3のヘリカルドメイン(以下HD)のをGαqのものに置換したキメラ体Gαiqiや、GPCR結合部位以外の全体の配列がGαq由来のGαqi5ではspecificityfactorが有意に小さかった(図2)。この結果は2種類のGPCRに共通していた。したがって、GPCRやGβγによらずGαのHDがGIRK開口の選択性を決定していることが示された。

2. GIRKとGαβγの直接の相互作用がファミリー選択的に生じる
　そこで、GIRKとGαi/oβγが直接結合し共局在することで選択性を決定しているという仮説のもと、精製したGIRKとGαi/oβγを用いて直接の相互作用を解析した。GIRKとしては、マウスGIRK1細胞内領域と原核生物のオルソログKirBac1.3の膜貫通領域からなるキメラ体チャネル(以降GIRK)を発現、精製して用いた。GIRKとGαi/oβγの相互作用があるとしたら、生体内では両者が膜に局在した状態で生じる。そこで、脂質二重膜をリポタンパク質が取り囲むことで膜環境を再現した可溶性粒子であるナノディスクにGIRKを再構成し(GIRK-ナノディスク)、生理的な相互作用を模倣した状態で解析に用いた。ヒト由来Gαi3およびGβ1γ2をそれぞれ発現、精製し、両者を混合してGαi3βγを調製した。Gタンパク質のファミリー間で違いがあるGαをNMRの観測対象とした。Gαi3βγは87K,GIRK-ナノディスクとの複合体は300Kと、NMR観測対象としては高分子量であるため、先鋭なシグナルを与えるIle, Leu, Val, Ala側鎖メチル基に選択的13C標識を施したGαi3を調製した。Gαi3βγ側鎖メチル基の1H-13CHMQCスペクトルを観測し、GIRK-ナノディスク添加に伴う変化から、結合が生じるか否かを調べた。
　Gαi3βγ11μMに対してGIRK-ナノディスク22μMを添加したところ、Gαi3の各シグナルに0.1程度の強度減少が生じた。これはGαi3βγの見かけの分子量の増大、すなわちGαi3βγの一部がGIRK-ナノディスクと複合体を形成したことを表す。この結果から、Gαi3βγとGIRK-ナノディスクが直接の相互作用を生じることが示された。同様の実験にて、前述のキメラ体Gαiqiβγは強度減少を生じなかったことから、Gαi3βγよりもGIRK-ナノディスクとの相互作用が減弱していることがわかった。1.の結果と合わせて、Gαi3βγとGIRKとの直接の相互作用が選択的に生じ、その相互作用がGIRK開口の選択性を決定していると結論した。

3. GIRKのC末端ヘリックスとGαi3βγのαAヘリックスの結合により複合体が形成される
　GIRKとGαi3βγの残基間の距離情報を、GIRKに部位特異的にスピンラベルTEMPOを修飾したときにGαi3βγに生じる分子間の常磁性緩和促進(PRE)効果の解析により取得し、GIRKとGαi3βγの複合体の構造を解明することを目指した。Gαi3βγ20µMに対して、TEMPO修飾GIRK-ナノディスク25µMを添加した際に、各シグナルに生じるPREを解析した。GIRKのC末端ヘリックスに位置するL366を修飾した場合、GαHDのαAとαBへリックスの間に位置するメチル基に5s-1以上の顕著なPREが観測され(図3A)、これらの部位が複合体中で近接することがわかった。
　GIRKの細胞内領域全体に分布する3残基を修飾部位としてPREデータを収集し、得られた距離情報を用いてGIRKとGαβγの結晶構造をもとにドッキングシミュレーションを行った。その結果、GIRKのC末端ヘリックスとGαi3のHDが結合していながら、GIRKのC末端ヘリックスとβ-strand regionとの間の構造自由度によりGIRKとGαi3βγの相対配置が様々に異なっている複数の構造のアンサンブルが、実験データをよく説明した(図3A)。アンサンブルに含まれる複数の構造の中でも、Gαi3βγの脂質修飾部位が膜に面した構造(図3B)が、生理的な膜上の相互作用を反映していると判断した。複合体中の主な結合部位はGIRKのC末端ヘリックスとGαi3HDのαAヘリックスであった。Gαi3のαAヘリックスを変異させたところ、BRET実験にてspecificity factorが有意に低下した(0.159±0.008; p<0.001 vs. Gαi3)ことから、αAヘリックスが選択性を決定していることが裏付けられた。

【考察】
　以上の結果を統合すると、GIRKのC末端ヘリックスがGαi/oのαAヘリックスを認識することで、選択的にGαi/oβγ-GIRK複合体が形成されGIRKの活性化が可能となっていることが示された。GαHDは配列全体にわたってGαファミリー間での保存性が低く、ファミリー選択性を担う部位はこれまで明らかとなっていなかった。本研究の結果から、Gαi3のHDの中でもαAヘリックスが、GIRKと直接結合し共役を決定する構造的要因であることが明らかとなった。
　GIRKがGαi/oと結合・共局在していることと、迅速にGβγ結合状態に移行し開口することは一見相反するが、これは本研究で示したGαi3βγ-GIRKの結合様式により説明できる。図4左のように、Gタンパク質は不活性化状態では3量体(Gαi/oβγ)としてGIRKと結合する。GPCRへのアゴニスト刺激に伴いGαi/oβγが活性化すると、Gαi/o(GTP)とGβγに解離し、それぞれGIRKと結合してGIRKが開口する。GPCRへの刺激が終了し、Gαに結合したGTPがGDPへ加水分解されると、Gαi/o(GDP)とGβγはそれぞれGIRKから解離し高親和性のGαi/oβγを再形成するためGIRKが閉口する。不活性化状態ではGαi/oβγのHDがGIRKのC末端ヘリックスと結合するのに対して、活性化時には解離したGαi/o(GTP)のGTPaseドメインがGIRKのC末端ヘリックスと、GβγがGIRKのβ-strand region上の結合部位と、それぞれ結合する(図4右)。各状態の結合様式を比較すると、GIRK上のGαi/oβγ結合部位はGβγ結合部位と重複しないため、Gαi/oβγから解離したGβγは妨げられずに迅速に複合体内のGIRKに結合し開口を誘起できる。また、Gαi/oは活性化・不活性化を通じてGIRKと相互作用し共局在し続けることで、Gαi/o選択性を維持している。以上の機構により、迅速かつ選択的なGIRKの活性制御が可能となっており、心臓や神経系での適切なシグナル伝達に貢献していると考察した。

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