抗原の変化が抗好中球細胞質抗体や抗糸球体基底膜抗体の検出と自己免疫病態に及ぼす影響

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抗原の変化が抗好中球細胞質抗体や抗糸球体基底膜抗体の検出と自己免疫病態に及ぼす影響

西端, 友香

北海道大学. 博士(保健科学) 乙第7180号

2023-06-30

10.14943/doctoral.r7180

http://hdl.handle.net/2115/90218

theses (doctoral)

Yuka_Nishibata.pdf

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Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP

学

位

論

⽂

抗原の変化が抗好中球細胞質抗体や抗⽷球体基底膜抗体の検出と
⾃⼰免疫病態に及ぼす影響

⻄

端

友

⾹

北海道⼤学⼤学院保健科学院

２０２３年度

⽬次
略語表 ................................................................................................................................... 2
要約 ...................................................................................................................................... 4
序章 ...................................................................................................................................... 7
第１章 間接蛍光抗体法の抗好中球細胞質抗体検出基板における好中球固定法の違いによ
る抗原性の変化................................................................................................................... 10
1-1.

緒⾔ ...................................................................................................................... 11

1-2.

対象と⽅法 ........................................................................................................... 14

1-3.

結果 ...................................................................................................................... 17

1-4.

考察 ...................................................................................................................... 26

1-5.

結論 ...................................................................................................................... 28

第 2 章 治療抵抗性抗⽷球体基底膜抗体病の抗⽷球体基底膜抗体が認識するエピトープ .. 29
2-1.

緒⾔ ...................................................................................................................... 30

2-2.

対象と⽅法 ........................................................................................................... 31

2-3.

結果 ...................................................................................................................... 35

2-4.

考察 ...................................................................................................................... 42

2-5.

結論 ...................................................................................................................... 45

第 3 章 抗好中球細胞質抗体に続き抗⽷球体基底膜抗体が産⽣されるメカニズム ............. 46
3-1.

緒⾔ ...................................................................................................................... 47

3-2.

対象と⽅法 ........................................................................................................... 48

3-3.

結果 ...................................................................................................................... 53

3-4.

考察 ...................................................................................................................... 65

3-5.

結論 ...................................................................................................................... 70

総括 .................................................................................................................................... 71
謝辞 .................................................................................................................................... 72
⽂献 .................................................................................................................................... 73
業績⼀覧 ............................................................................................................................. 82

1

略語表
AAV

: anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis

ANA

: anti-nuclear antibody

ANCA

: anti-neutrophil cytoplasmic antibody

AP

: alkaline phosphatase

APCs

: antigen-presenting cells

BPI

: bactericidal permeability increasing protein

c-ANCA

: cytoplasmic ANCA

CBB

: Coomassie brilliant blue

Col(IV)

: type IV collagen

CRP

: C-reactive protein

DAB

: 3,3'-diaminobenzidine

DAPI

: 4,6-diamidino-2-phenylindole

EGPA

: eosinophilic granulomatosis with polyangiitis

EIA

: enzyme immunoassay

ELISA

: enzyme-linked immunosorbent assay

FCM

: flow cytometry

FEIA

: fluorescence enzyme immunoassay

FFPE

: formalin-fixed paraffin-embedded

FITC

: fluorescein isothiocyanate

GBM

: glomerular basement membrane

GPA

: granulomatosis with polyangiitis

HE

: hematoxylin and eosin

HRP

: horseradish peroxidase

IBD

: inflammatory bowel diseases

IF

: immunofluorescence

Ig

: immunoglobulin

IgAN

: immunoglobulin A nephropathy

IHC

: immunohistochemistry

IIF

: indirect immunofluorescence

2

LAMP-2

: lysosome-associated membrane protein-2

MFI

: mean fluorescence intensity

MHC

: major histocompatibility complex

MMP-9

: matrix metalloproteinase-9

MPA

: microscopic polyangiitis

MPO

: myeloperoxidase

MS

: multiple sclerosis

NE

: neutrophil elastase

p-ANCA

: perinuclear ANCA

PBS

: phosphate-buffered saline

PBS-T

: phosphate-buffered saline with 0.05％ Tween-20

PC

: positive control

PFA

: paraformaldehyde

PMA

: phorbol myristate acetate

PMNs

: polymorphonuclear leukocytes

PN

: periarteritis nodosa

PR3

: proteinase 3

PVDF

: polyvinylidene difluoride

RR

: repeat relapse

SA

: single attack

SD

: standard deviation

SDS

: sodium dodecyl sulfate

SE

: standard error

TMB

: 3,3,5,5-tetramethylbenzidine

TNF-α

: tumor necrosis factor-α

WKY

: Wistar-Kyoto

α3(IV)NC1

: α3-subunit non-collagenous domain of type IV collagen

3

要約
抗好中球細胞質抗体 (anti-neutrophil cytoplasmic antibody: ANCA) は好中球細胞質抗原
を認識する病原性⾃⼰抗体であり、主な抗原はミエロペルオキシダーゼとプロテイナーゼ 3
である。抗⽷球体基底膜 (glomerular basement membrane: GBM) 抗体が認識する主要な
エピトープは⽷球体および肺胞の基底膜を構成する IV 型コラーゲン {type IV collagen:
Col(IV)} のα3 サブユニット⾮コラーゲンドメイン、α3(IV)NC1 に存在する。NC1 ドメ
インの六量体形成によって⽴体構造的に分⼦内に潜在している GBM 抗原のエピトープは、
同六量体が解離することにより表出し、抗体と結合する。
本研究では、ANCA 抗原および GBM 抗原の変化が ANCA や抗 GBM 抗体の検出と⾃⼰
免疫病態へ与える影響について検討した。
第1章

間接蛍光抗体法の抗好中球細胞質抗体検出基板における好中球固定法の違いによ
る抗原性の変化

【背景と⽬的】ANCA の検出には間接蛍光抗体法 (indirect immunofluorescence: IIF) や酵
素免疫測定法 (enzyme immunoassay: EIA) が⽤いられてきた。精度の向上により近年は
EIA が ANCA 検出のゴールドスタンダードとなっているが、EIA では固相化された抗原以
外を認識する ANCA は検出できないため、IIF も依然として必要とされている。IIF ではエ
タノール固定もしくはホルマリン固定した好中球を基板として⽤いる。エタノール固定に
は推奨プロトコールがあるが、ホルマリン固定には推奨プロトコールがない。そこで、いく
つかのホルマリン固定プロトコールについて、保存期間が基板の細胞数、抗原分布および抗
原性にどのような影響を及ぼすかを明らかにすることを⽬的とした。
【⽅法】エタノール固定の推奨プロトコールならびに、既報およびオリジナルのホルマリン
固定プロトコールに従って ANCA-IIF ⽤好中球基板を作製した。作製直後、2 週間後、1 か
⽉後、2 か⽉後に ANCA-IIF を施⾏し、細胞数、抗原分布および抗原性を解析した。
【結果】細胞数および抗原分布は固定法によらず 2 か⽉間変化がなかったが、抗原性には
プロトコール依存的な経時的減衰が認められた。
【結論】経時的な抗原性の減衰は ANCA-IIF の判定に影響を及ぼす恐れがあり、抗体価評
価の際には注意が必要である。
第2章

治療抵抗性抗⽷球体基底膜抗体病の抗⽷球体基底膜抗体が認識するエピトープ

【背景と⽬的】抗 GBM 抗体病（抗 GBM 病）の抗 GBM 抗体が認識する主要なエピトープ
はα3(IV)NC1 である。抗 GBM 病は通常は単回発症 (single attack: SA) の経過をとり、治
療抵抗性を⽰し再燃を繰り返す (repeat relapse: RR) ことは稀である。そこで、RR 患者と
SA 患者の抗 GBM 抗体が認識するエピトープの違いを明らかにすることを⽬的とした。
【⽅法】ホルマリン固定パラフィン包埋 (formalin-fixed paraffin-embedded: FFPE) 正常腎
4

組 織 切 ⽚ の 免 疫 組 織 化 学 (immunohistochemistry: IHC) と 、 リ コ ン ビ ナ ン ト ヒ ト α
3(IV)NC1 を⽤いたウェスタンブロッティングを実施した。
【結果】RR 患者の免疫グロブリン G (immunoglobulin G: IgG) を⼀次抗体とした IHC は、
SA 患者の IgG を⼀次抗体とした IHC で観察された染⾊像とは異なる染⾊像を呈した。ウ
ェスタンブロッティングでは、RR 患者の IgG は whole のα3(IV)NC1 に相当する 56.8 kDa
の抗原以外に 18 kDa の抗原にも反応した。α3(IV)NC1 をプロテアーゼで消化すると 56.8
kDa のバンドは消失したが、18 kDa のバンドは消失しなかった。また、市販の抗α3(IV)NC1
モノクローナル抗体では 18 kDa のバンドは検出されなかった。
【結論】RR 患者の IgG は、SA 患者や抗α3(IV)NC1 モノクローナル抗体が認識するエピ
トープとは異なる GBM エピトープを認識しており、それが臨床経過の違いに反映されて
いる可能性が⽰唆された。
第3章

抗好中球細胞質抗体に続き抗⽷球体基底膜抗体が産⽣されるメカニズム

【背景と⽬的】ANCA 関連⾎管炎 (ANCA-associated vasculitis: AAV) は抗 GBM 病を合併
することがある。本研究では、AAV における抗 GBM 抗体産⽣メカニズムを明らかにする
ことを⽬的にした。
【⽅法】ANCA により活性化された好中球から放出されるエラスターゼなどのプロテアー
ゼが AAV の病態に関与することが知られている。そこで、FFPE 正常腎組織切⽚と Col(IV)
を好中球エラスターゼなどのプロテアーゼで消化し、α3(IV)NC1 が表出するかどうかを
IHC と enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) を⽤いて検討した。次に、AAV 患者
などの腎病変部におけるα3(IV)NC1 の表出と CD11c 陽性マクロファージの浸潤を IHC お
よび蛍光抗体法により評価した。最後に、AAV モデルラットの抗 GBM 抗体産⽣を ELISA
で評価した。
【結果】FFPE 正常腎組織切⽚と Col(IV)をプロテアーゼで消化することによりα3(IV)NC1
が表出した。α3(IV)NC1 の表出は原因疾患に関係なく硬化⽷球体で認められたが、α
3(IV)NC1 近傍に浸潤する CD11c 陽性マクロファージは AAV に特徴的であった。⼀部の
AAV ラットでは、ANCA に続いて抗 GBM 抗体が産⽣された。IHC では、障害された腎組
織中にα3(IV)NC1 が検出され、その近傍に CD11c 陽性マクロファージが浸潤しているこ
とが確認された。
【結論】AAV において、ANCA によって活性化された好中球から放出されるプロテアーゼ
が Col(IV)を消化して⽷球体のα3(IV)NC1 を表出させ、CD11c 陽性マクロファージが
GBM エピトープを提⽰し、最終的に免疫系が抗 GBM 抗体を産⽣することが⽰唆された。
本研究は AAV における抗 GBM 抗体産⽣に分⼦間エピトープ拡散 intermolecular epitope
spreading が関与すること⽰唆した初めての研究である。
抗原の変化は ANCA や抗 GBM 抗体といった病原性⾃⼰抗体の検出結果ならびに⾃⼰免
5

疫病態へ影響を与える。AAV や抗 GBM 病において、⾃⼰抗体が認識する抗原エピトープ
の違いや産⽣される⾃⼰抗体の種類の増加は、病態の重症化や修飾に関与することが⽰唆
された。

6

序章
⼩型⾎管炎
細動脈、⽑細⾎管、細静脈といった⼩型⾎管が主として侵される⾎管炎を⼩型⾎管炎とい
う。国際的な⾎管炎分類であるチャペルヒル分類 2012 では、⼩型⾎管炎は抗好中球細胞質
抗 体 (anti-neutrophil cytoplasmic antibody: ANCA) 関 連 ⾎ 管 炎 (ANCA-associated
vasculitis: AAV) と免疫複合体性⾎管炎に⼤別されている (Jennette et al., 2013)。AAV は
ANCA 産⽣を伴う壊死性⾎管炎と定義され、⾎管壁への免疫グロブリン(immunoglobulin:
Ig)や補体の沈着はほとんど認められない。主な ANCA 抗原には、ミエロペルオキシダーゼ
(myeloperoxidase: MPO) とプロテイナーゼ 3 (proteinase 3: PR3) の 2 つがある。免疫複
合体性⾎管炎は⾎管壁に Ig や補体が中程度から⾼度に沈着する⾎管炎と定義され、抗⽷球
体基底膜 (glomerular basement membrane: GBM) 抗体病（抗 GBM 病）やクリオグロブリ
ン⾎症性⾎管炎などが含まれる。抗 GBM 病では患者腎組織を⽤いた免疫蛍光染⾊
(immunofluorescence: IF) において GBM に沿った線状の IgG 沈着が観察される。
AAV と ANCA 抗原
AAV には、顕微鏡的多発⾎管炎 (microscopic polyangiitis: MPA)、多発⾎管炎性⾁芽腫
症 (granulomatosis with polyangiitis: GPA)、好酸球性多発⾎管炎性⾁芽腫症 (eosinophilic
granulomatosis with polyangiitis: EGPA) などが含まれる。MPA は、⽷球体係蹄の壊死と半
⽉体形成を伴う急速進⾏性の⽷球体腎炎を発症し、肺では⽑細⾎管炎による肺出⾎が起こ
る。本邦における全国規模のコホート研究により、MPA の平均発症年齢は 70 歳代である
こと、ほとんどの患者が MPO-ANCA 陽性であることが分かっている (Sada et al., 2014)。
GPA は、上・下気道に壊死性⾁芽腫、全⾝⼩型⾎管に壊死性⾁芽腫性⾎管炎をきたし、60
歳代に好発する。また、GPA では MPO-ANCA 陽性患者と PR3-ANCA 陽性患者の割合が
ほぼ等しい。EGPA は、気管⽀喘息や好酸球増多などのアレルギー症状を伴う全⾝性の壊死
性⾁芽腫性⾎管炎で、50 歳代に発症のピークがある。EGPA 患者の約半数は MPO-ANCA
陽性であるが、残りの約半数は ANCA 陰性である。 ...

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