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癌患者ゲノミクスデータ解析を基盤とした乳癌幹細胞性維持機構の解明

多森 翔馬 Shoma Tamori 東京理科大学 DOI:info:doi/10.20604/00003611

2021.06.09

概要

近年のゲノム解析技術の革新的な発展により、癌医療においては患者の治療歴やゲノム情報に基づき個々人に最適な医療提供の実現が可能となってきた。本邦においては 2019 年に遺伝子パネル検査が保険収載され、癌と肉腫に対して従来の臓器毎の治療から遺伝子変異毎の癌治療を提供する精密医療(プレシジョンメディシン)に変わりつつある。現行の遺伝子パネル検査においては癌患者の病変部の遺伝子変異を網羅的に解析し、患者それぞれの遺伝子変異に対応する薬を適切に選択する医療が期待されている。国内で行われた NCCオンコパネルテスト(114 の癌関連遺伝子の遺伝子変異解析)では、データの得られた 187症例中 156 例(83.4%)で何らかの遺伝子変異が検出され、そのうち 109 症例(58.2%)においてアクショナブル変異(既存もしくは評価中の分子標的治療薬に対する感受性ないし抵抗性を規定する遺伝子変異)が認められている。しかしながら、試験登録終了から約 1 年間の追跡期間中に遺伝子変異に基づいた分子標的治療が実施された症例は 25 例(13.4%)と限定的であり、保険診療として治療がなされたのは 6 症例であった。すなわち、遺伝子パネル検査により治療標的となり得るアクショナブルな遺伝子変異が検出される割合は高いものの、利用可能な薬剤がないことや当該癌種が適応でないなどの様々な理由から、遺伝子変異に基づく治療に到達する可能性は決して高くない。従って、このギャップを埋めるためには、遺伝子変異に対する治療薬開発を待つだけでなく、遺伝子発現量などのオミックスデータを加えて詳細に癌患者を層別化し、その層別化に見合う医療提供のための治療薬開発を進めることが重要である。

乳癌は世界において女性に最も一般的に発生する癌である。国際癌研究機関(IARC)の報告によると 2018 年には 209 万人が乳癌に新規に罹患し(女性の全癌罹患数の 24%)、乳癌による死亡者数は 63 万人(女性の全癌死亡数の 15%)と推定されている。乳癌は患者の層別化による治療選択が進んだ癌の一つである。乳癌は、免疫組織化学(IHC)に基づいてホルモン受容体 ER、PgR と HER2 の発現の組み合わせにより 4 つに分類される。現在、主にこの分類による治療選択がなされており、薬物療法に関してはホルモン受容体陽性型に対するホルモン療法および HER2 型に対する抗 HER2 療法が存在する。しかしながら、これらの受容体のすべてが陰性であるトリプルネガティブ型乳癌(TNBC)に対しては明確な治療薬が存在せず、概して予後不良である。一方、IHC による分類は患者個人の予後や治療効果を予測するには十分でないことから、個々の患者の再発リスクまた治療効果を適切に判断するために、患者のゲノミクス情報による分類法が開発されている。乳癌は遺伝子発現パターン(PAM50)に基づいて、少なくとも 6 つのサブタイプに分類される(Normal-like, Luminal A, Luminal B, HER2-enriched, Claudin-low, Basal-like)。これらの中で Luminal A 型と Luminal B 型は ER 陽性であり、一部の Luminal B 型と HER2-enriched 型は HER2 陽性である。Claudin-low 型と Basal-like 型の大半はTNBC 型と重複し、これらのサブタイプは概して予後不良である。Claudin-low 型と Basal-like 型の大半が属する TNBC 型は癌幹細胞性が高いことが特徴であり、進行が早く、悪性度および浸潤能が高いために早期に再発する。正常組織の組織幹/前駆細胞は組織を構成する様々な分化細胞を生み出すが、同様に癌組織を構成している細胞集団は、異常分化した様々な細胞とそれを生み出すごく少数の癌幹細胞から生じると考えられるようになってきている。癌幹細胞は特性(癌幹細胞性)として自己複製能・多分化能・腫瘍形成能を併せ持ち、従来の抗癌剤治療や放射線治療に抵抗性を示す。そのため、治療により残存した癌幹細胞は癌の再発・転移の原因となる。従って、Claudin- low 型と Basal-like 型に対しては、単なる癌細胞を標的とするだけでなく、癌幹細胞の癌幹細胞性を標的とした治療薬の創製が課題と考えられる。そのためには、これらの癌における癌幹細胞性維持機構を分子レベルで明らかにし、その知見に基づいた治療薬を開発することが重要である。

本研究では、乳癌患者の遺伝子サブタイプ分類による層別化とClaudin-low 型・Basal-like型乳癌の癌幹細胞性を標的とした治療提供の実現を想定した。そのために、まず乳癌患者を遺伝子サブタイプ分類により層別化した際の着目分子の遺伝子発現の意義について明らかにすることを目的とした。さらにその上で、着目分子が Claudin-low 型と Basal-like 型に対する新規治療標的、つまり癌幹細胞の癌幹細胞性を標的とした治療標的候補分子となり得るか否かについて明らかにするために、ALDH1 陽性癌幹細胞における着目分子の幹細胞性維持機構への関わりを調べることを目的とした。

解析方法として公共の癌患者ゲノムミクスデータベース Oncomine (https://www.oncomine.org/)と cBioportal (http://www.cbioportal.org/)を用いた。これらのデータベースからダウンロードした乳癌患者ゲノミクスデータ(TCGA, Nature 2012, 593 検体,METABRIC, Nature 2012 & Nature Commun. 2016, 1904 検体)は、乳癌患者の臨床情報と正常 組織および原発組織の遺伝子変異・遺伝子発現情報などのオミックスデータを統合して解析に用いることができる。In vitro 実験においては、ALDH1 陽性癌幹細胞に焦点を当てた。第一章では、情報理論を駆使した乳癌患者ゲノミクスデータ解析から、ER 陽性乳癌の予後不良と相関する分子として同定されたナトリウム/無機リン酸共輸送体 SLC20A1 について解析を行った。まず、乳癌患者ゲノミクスデータ(TCGA, Nature 2012, 593 検体)を用いて癌患者の正常組織と癌組織の SLC20A1 遺伝子発現を比較した。その結果、癌組織において有意に SLC20A1 遺伝子発現が高かった。次に、乳癌患者ゲノミクスデータ(METABRIC, Nature 2012 & Nature Commun. 2016, 1904 検体)を用いて遺伝子サブタイプ毎に Overall survival(OS)と Disease-specific survival(DSS)をアウトカムとして SLC20A1 発現と患者の予後との関係をKaplan-Meier 法により調べた。その結果、ER 陽性型であるLuminal A 型・Luminal B 型だけでなくClaudin-low 型・Basal-like 型においても SLC20A1 高発現群は SLC20A1 低発現群よりも予後不良だった。このことから、SLC20A1 高発現がClaudin-low 型・Basal-like 型乳癌の予後予測因子となり得ることが示唆された。また、従来の遺伝子サブタイプ分類に加えてSLC20A1 の発現量により患者をさらに層別化することが重要であることを示唆された。さらに、化学療法の有無と放射線療法の有無により患者を分けて同様の解析を行った。その 結果、化学療法無しで治療された SLC20A1 高発現群は SLC20A1 低発現群よりも予後不良 であった。対照的に、化学療法有りで治療された患者群では、SLC20A1 高発現群は SLC20A1 低発現群と比較して予後に顕著な差がなかった。一方で、放射線療法については放射線療法 の有無にかかわらず、SLC20A1 高発現群は SLC20A1 低発現群よりも有意に予後不良であった。このことから、Claudin-low 型・Basal-like 型乳癌の SLC20A1 高発現患者に対しては放 射線療法よりも化学療法が有効である可能性が示された。前述の結果を踏まえ、Claudin-low 型および Basal-like 型乳癌における SLC20A1 の役割を調べた。各サブタイプの乳癌細胞株(MCF-7;Luminal A / ER+, MDA-MB 231;Claudin-low / TNBC, MDA-MB 468;Basal-like / TNBC, MDA-MB 157;TNBC)を用いて WST-8 assay を行った結果、SLC20A1 の siRNA ノックダウンによりいずれにおいても細胞増殖/生存率が低下した。さらに、ALDH1 陽性癌幹細胞における SLC20A1 の幹細胞性維持への関わりを調べるために、ALDEFLUOR assay により MDA-MB 231、MDA-MB 468 および MDA-MB 157 から ALDH1high 細胞を分取して ALDH1high 細胞数の変化と in vitro での腫瘍形成能の変化を調べた。その結果、いずれの細胞株においてもSLC20A1 ノックダウンによりALDH1high 細胞数が減少した。また、MDA-MB 231、MDA-MB 468 および MDA-MB 157 由来の ALDH1high 細胞による in vitro におけるtumor sphere 形成が抑制された。これらの結果は、SLC20A1 が Claudin-low 型および Basal-like 型乳癌における ALDH1 陽性癌幹細胞による増殖/生存および腫瘍形成能に重要な役割を果たしていることを示唆している。以上のことから、乳癌遺伝子サブタイプに加えて SLC20A1遺伝子発現により患者を層別化し、Claudin-low 型・Basal-like 型乳癌の ALDH1 陽性癌幹細胞に対して SLC20A1 を標的とすることが Claudin-low 型・Basal-like 型乳癌患者への有効な治療となる可能性が示された。

第二章では、癌幹細胞の代謝特性に着目した解析を行った。乳癌幹細胞マーカーである ALDH1 は細胞内アルデヒドをカルボン酸に解毒する代謝酵素としての役割をもつ。癌幹細胞では生存や増殖に必要な多量なエネルギーに加えて生体分子の合成材料及び抗活性酸素種(ROS)分子の供給を必要とすることから、様々な代謝機構が活性化しており、ALDH1 は機能的に様々な代謝機構とクロストークすることが示唆されている。そのひとつとして、癌細胞ひいては癌幹細胞では正常細胞よりも解糖系が亢進している(Warburg 効果)ことが知られているが、解糖系の亢進と ALDH1 陽性癌幹細胞の幹細胞性維持機構との関わりについては不明な点が多い。解糖系代謝酵素のひとつである Glyoxalase 1(GLO1)は解糖系中間代謝産物であり細胞毒性を有する Methylglyoxal(MG)を解毒する代謝酵素である。細胞内において MG は DNA/RNA およびタンパク質との反応性が高く、細胞内 MG の蓄積は癌細胞にアポトーシスを誘導する。GLO1 は様々な癌で遺伝子およびタンパク質が高発現し、一部の癌では活性も亢進している。このことから、癌細胞における GLO1 の阻害は MG の蓄積を介して癌細胞のアポトーシス誘導を期待できることから、GLO1 は癌の治療標的分子として着目されている。しかしながら癌幹細胞における GLO1 の役割は不明な点が多い。本研究では、まず乳癌患者ゲノミクスデータ(TCGA, Nature 2012, 593 検体)により癌患者の正常組織と癌組織の GLO1 遺伝子発現を比較した。その結果、癌組織において有意に GLO1 遺伝子発現が高かった。さらに、乳癌患者ゲノミクスデータ(METABRIC, Nature 2012 & Nature Commun. 2016, 1904 検体)を用いてGLO1 遺伝子発現と臨床病理学的パラメータとの関わりを調べたところ、GLO1 遺伝子発現は幹細胞性および悪性度が高い組織学的グレード 3 乳癌において高かった。また、乳癌サブタイプの中では GLO1 遺伝子発現はBasal-like 型において高かった。加えて、Basal-like 型乳癌の 9 割が組織学的グレード 3 であり、癌幹細胞マーカー遺伝子 ALDH1A3 の発現が高かった。そこで、Basal-like 型ヒト乳癌細胞株 MDA-MB 157、MDA-MB 468 からALDH1 陽性乳癌幹細胞を濃縮しているALDH1high 細胞を分取して、 GLO1 阻害剤 TLSC702 を投与した結果、濃度依存的に細胞増殖とtumor sphere 形成を抑制した。さらに、TLSC702 は ALDH1high 細胞のアポトーシスを誘導した。同様に、GLO1 を siRNA ノックダウンすると、ALDH1high 細胞のアポトーシスを誘導した。これらの結果は、 GLO1 が Basal-like 型乳癌の細胞増殖/生存および ALDH1 陽性癌幹細胞による腫瘍形成に重要な役割を果たしていることを示唆している。以上のことから、乳癌を遺伝子サブタイプにより層別化し、Basal-like 型乳癌の ALDH1 陽性癌幹細胞に対して GLO1 を標的とすることが Basal-like 型乳癌患者への有効な治療となる可能性が示された。

本研究は、Claudin-low 型・Basal-like 型乳癌における ALDH1 陽性癌幹細胞の癌幹細胞性 維持機構の一端を明らかにしたものであり、今後の更なる詳細な解析が癌幹細胞性を標的 とした新規分子標的薬の開発につながる知見と考えられる。現行の癌遺伝子パネル検査に 基づく精密医療は癌細胞の主に遺伝子変異を標的とした治療薬の選定を中心としているが、近年の技術革新により、癌患者検体のゲノム情報だけでなく、エピゲノム、トランスクリプ トーム、プロテオーム、メタボロームなどの様々なオミックスデータが解析できるようにな ってきている。本研究は癌医療における位置づけとして、癌細胞の遺伝子変異(ゲノム情報)だけでなくエピゲノム情報と遺伝子発現量(トランスクリプトーム)を考慮した解析の重要 性を示している。特に、進行が早く悪性度の高い Claudin-low 型や Basal-like 型乳癌におけ る癌幹細胞を標的とした新規分子標的薬の創製の理論的基盤となり得る。さらに、SLC20A1 や GLO1 の発現量に基づく患者の層別化は患者個別の癌予防・癌治療に役立つ可能性があ り、将来の精密医療に貢献する知見である。

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