論文の公開元へThe ELEANOR noncoding RNA expression contributes to cancer dormancy and predicts late recurrence of estrogen receptor-positive breast cancer
概要
【緒言】
近年の乳癌診療における診断法や治療法の進歩にも関わらず、エストロゲン受容体 (ER)陽性乳癌患者では、依然として術後 5 年以降の晩期再発が多く、再発予測マーカーや治療標的を同定することが課題となっている。晩期再発は、播種性腫瘍細胞 (disseminated tumor cell：DTC)が遠隔転移先で長期間の dormant(休眠)状態に入り、増殖に適した環境が整った後に再増殖する能力を反映すると考えられる。DTC は癌幹細胞性を有し、薬物治療耐性に寄与することが報告されているが、そのメカニズムは明らかでない。
エレノア(ESR1 locus enhancing and activating non-coding RNAs)は、タンパク質をコードしない一群のノンコーディング RNA で、内分泌療法抵抗性乳癌再発モデル LTED(long term estrogen deprivation)細胞において、ESR1 遺伝子と上流 3 遺伝子のゲノム領域から過剰発現し、核内で RNA クラウドと呼ばれる凝集体を形成する。エレノアは約 1 Mb(chr6: 151,750,000–152,750,000)のエレノア TAD(topologically associating domain)を規定し、ESR1 遺伝子の転写を活性化して細胞増殖に寄与することが培養細胞実験で示されている。本研究では、エレノアの臨床意義を明らかにするため、原発乳癌と再発乳癌の臨床サンプルを用いてエレノアの発現解析を行い、また、分子機序解析でエレノアによる癌幹細胞維持や癌幹細胞遺伝子の活性化を検証した。
【対象及び方法】
ヒト乳癌サンプル のエレノア発現解析
2005 年 5 月～2006 年 12 月にがん研有明病院で切除手術が施行された病理学的浸潤径が 2–5cm(pT2)の原発性乳癌 185 例(コホート 1)、2000 年 1 月～2016 年 12 月にがん研有明病院で原発性乳癌に対する切除手術が行われ、その後再発し、転移巣に対して生検または切除手術が行われた ER 陽性乳癌 167 例(コホート 2)の乳癌組織の FFPE を用いて、RNA-FISH 法でエレノアの発現解析を行った。エレノアの判定は、エレノアスコア 0 (エレノアクラウドなし)、スコア 1 (エレノアクラウド小)、スコア 2 (エレノアクラウド大)に分類し、スコア 1，2 をエレノア陽性と定義した(図 1A)。コホート 1 では、エレノア発現と臨床病理学的因子及び予後との相関を解析し、コホート 2 では、エレノア発現の再発後の変化を検討した。統計解析は、2 群間の割合の比較には Pearson のカイ 2 乗検定、2 群間の順序変数間の相関は Spearman の順位相関係数(rs)を用いて以下のように定義した：非常に弱い（0.00〜0.19)、弱い（0.20〜0.39)、中程度(0.40〜0.69)、強い(0.70〜0.89)、非常に強い(0.90〜1.00)。生存曲線の推定には Kaplan-Meier 法、2 群間の生存曲線の比較には log-rank 検定を用いた(JMP®13.2.1 software)。P 値 0.05 未満を統計学的に有意と判断した。
エレノアの癌幹細胞維持の解析
エレノアが高発現する LTED 細胞を用いて、癌幹細胞性を評価するスフェア形成アッセイを行い、FACS 解析でエレノア阻害後の乳癌癌幹細胞(CD44 陽性 CD24 陰性細胞)の割合を評価した。また、エレノアと癌幹細胞遺伝子 CD44 の相関を RT-qPCR、ウェスタンブロット、免疫染色、RNA-FISH で解析した。
エレノアのマウス個体における機能解析では、卵巣除去にてエストロゲン枯渇状態を再現した免疫不全マウス(NOD/Scid、♀、8 週齢)の下腹部乳腺近傍の脂肪組織内に、 5×106 個の HCC1428 と HCC1428-LTED 細胞を各 8 匹ずつ移植した。腫瘍細胞移植後、1 週間毎に腫瘍体積を測定し、腫瘍形成、増殖能を評価した。3 か月後に移植腫瘍を摘出し、RT-qPCR、免疫染色、RNA-FISH を行った。
【結果】
コホート 1 の原発性乳癌 178 例(判定不能 8 例を除外)の RNA-FISH の結果、58 例 (33%)にエレノアクラウドを認めた(図 1B)。乳癌サブタイプ別のエレノア陽性率は、 Luminal A(ER 陽性、低悪性度)で 43%、Luminal B(ER 陽性、高悪性度)で 37%、Luminal- HER2(ER 陽性 HER2 陽性)タイプで 57%であり、ER 陰性 HER2 陽性及びトリプルネ ガティブタイプ(ER 陰性 HER2 陰性)は全例でエレノア陰性であった(図 1B)。エレノ アは閉経後の患者に多く認められ、Allred スコアを用いた ER の発現強度とエレノア スコアに弱い正の相関が認められた(図 1C)。ER 陽性乳癌における予後解析の結果、 無再発生存率(RFS)はエレノア陽性群で予後不良であり、特に術後 5 年以降の再発が 増加し、生存率はエレノア陽性群で術後 8 年以降に予後不良の傾向を認めた(図 1D)。多変量解析の結果、エレノア陽性は独立した再発リスク因子であった(ハザード比 2.40、 P=0.014)。コホート 2 の再発乳癌 139 例(判定不能 28 例を除外)においても同様に、原 発巣のエレノア陽性群は再発までの期間が長く、晩期再発が多い傾向を示した(図 2A)。 RNA-FISH でコホート 2 の原発巣と転移巣のエレノア発現を比較すると(図 2B)、エレ ノア陽性例は原発巣で 45 例(32%)、転移巣で 40 例(29%)と同等で、114 例(83%)は原 発巣と転移巣でエレノアの発現状態が一致していた。また、原発巣のエレノア陽性群 では、再発後に ER/PgR が陰転化する症例が少なく(図 2C)、エレノアが乳癌の進行再 発の過程で ER/PgR の発現を維持することが示唆された。
次に、エレノアが晩期再発に関わる分子機構を明らかにするため、培養細胞実験でエレノアの癌幹細胞への寄与を評価した。ER 陽性乳癌細胞株 HCC1428 とエレノアが高発現する HCC1428-LTED 細胞のス➚ィア形成能を比較すると、HCC1428-LTED 細胞で高いス➚ィア形成能が観察された(図 3A)。HCC1428-LTED 細胞のエレノアを阻害すると FACS 解析で乳癌癌幹細胞(CD44 陽性/CD24 陰性)の割合が減少することが示された。また、エレノアを高発現する LTED 細胞では癌幹細胞遺伝子 CD44 の mRNAの転写が活性化し(図 3C)、エレノアを阻害すると CD44 の転写が抑制された(図 3D)。 CD44 のタンパク質発現も同様にエレノアと相関を認めた(図 3E, 3F)。一方、HCC1428- LTED 細胞の ESR1mRNA を阻害しても CD44 の転写は抑制されないことから、エレノアは ER 経路を介さずに CD44 の転写を活性化する可能性が示唆された(図 3G, 3H)。さらに、HCC1428-LTED 細胞で CD44 を阻害するとス➚ィア形成能が有意に抑制され、エレノアによる CD44 遺伝子の活性化が癌幹細胞性に寄与することが示された(図 4A)。
続いて、マウス異種移植モデルを用いてエレノアの腫瘍形成能を評価した。HCC1428細胞を卵巣摘出後のマウスに移植しても腫瘍形成を認めなかったが、HCC1428-LTED細胞は ER とエレノアが高発現する腫瘍を形成し、エレノアの癌幹細胞への寄与とエストロゲン低レベル状態への耐性が示された(図 4B)。マウスから摘出した HCC1428- LTED 細胞由来の腫瘍の RNA-FISH の結果、エレノア(Chr.6)と異なる染色体上の CD44(Chr.11)間に相互作用が示唆された(図 4C)。さらに、コホート 1 の原発乳癌検体で CD44 の発現を免疫染色で評価したところ、エレノア陽性群に CD44 陽性例が多く、エレノアと Allred スコアによる CD44 の発現強度スコアの間に非常に弱い～弱い相関が観察された(図 4D)。
【考察】
ER 陽性乳癌におけるエレノアの発現が晩期再発の重要な予後指標であることが示された。エレノアの発現は閉経後の原発性乳癌患者に多く認められ、生理的なエストロゲン低レベル状態により誘導される可能性が考えられた。培養細胞実験の知見に一致して、エレノアは ER 強陽性の乳癌に高発現し、再発後の ER/PgR 陽性を維持する傾向が認められた。エレノアは ESR1 と近傍遺伝子の転写を活性化することが明らかにされているが、本研究により、異なる染色体上の CD44 遺伝子と相互作用を持ち、転写活性の場を形成する可能性が示唆された。エレノアはアポトーシス遺伝子 FOXO3を含む TAD との相互作用により増殖と細胞死のバランスを保ちやすい性質が報告されており、これに加えて、CD44 遺伝子の転写活性化を介して癌細胞の休眠や治療耐性を促進し、晩期再発に関与することが示唆された(図 4E)。
【結論】
エレノアは、ER 陽性乳癌の晩期再発の予測指標や癌幹細胞を標的とした新規治療法、晩期再発機構の解明に役立つ可能性がある。
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