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Indoxyl Sulfate-induced Vascular Calcification is mediated through Altered Notch Signaling Pathway in Vascular Smooth Muscle Cells

山口, 和才 名古屋大学

2021.07.16

概要

【緒言】
　インドキシル硫酸(Indoxyl Sulfate：IS)は慢性腎臓病(CKD)患者において血中に蓄積する主要な尿毒素であり、心血管疾患の発症率・致死率と関連する事が知られている。また、IS は CKD 患者における血管石灰化にも関与している事が報告されているが、そのメカニズムは複雑であり、まだ完全には解明されていない。Notch シグナルは、多細胞生物において高度に保存されたシグナル伝達経路であり、細胞の分化や増殖を制御する。我々は以前、Notch シグナルが血管平滑筋にも高度に発現している事を報告した。今回、「IS により誘発される血管石灰化に Notch シグナルが関与している」という仮説を立て、本研究を立案した。

【方法・結果】
　食塩感受性高血圧ラットモデルであるダール食塩感受性ラットを、0.3％食塩水を負荷した群(DS 群)、2％食塩水を 32 週負荷した群(DH 群)、2％食塩水負荷と IS(200 mg/kg/day)を 32 週負荷した群(DH＋IS 群)の 3 群に分け、検討を行った。大動脈の HE染色、von-kossa 染色において、DH＋IS 群のみ中膜、及び冠動脈周囲の石灰化を認めた (Figure 1)。次に大動脈における Notch シグナルの発現を調べる評価するために Notch1、Notch3、および Notch の下流転写因子である Hes1 の免疫染色を行った結果、 Notch1、Notch3、Hes1 ともに、DS、DH 群では均一に発現を認めたが、DH＋IS 群では中膜の中心部、石灰化周囲において発現が低下していた (Figure 2)。また大動脈における notch 関連分子の発現を、RT-PCR 法 、ウェスタンブロッティング法にて検討したところ、DH＋IS 群では、Notch リガンド(Jagged1、DLL4)、Notch 受容体(Notch1、 Notch3)、Notch 下部転写因子(Hes-1、Hey-1)の発現が有意に低下していた (Figure 3)。次に、RT-PCR 法にて石灰化関連マーカーの評価を行った結果、DH＋IS 群では、骨形成マーカーである RUNX2、OPN、OCN、ALP、OSX、MSX1、MSX2、BMPs2 の上昇を認め、一方で平滑筋マーカーである SM22 の低下を認めた (Figure 4)。
　次に、IS と Notch シグナルの関連を詳細に検討するために大動脈平滑筋細胞(aortic SMCs)を用いて検討した。 Aortic SMCs に IS を負荷し、IS の濃度による Notch1、 Notch3 の発現を評価したところ、いずれも 500μM で最大となった (Figure 5b, d, f, h)。 500μM の IS を負荷し、負荷時間による Notch1、Notch3 の発現を評価したところ、いずれも一過性に発現が亢進したが、その後長時間(96h)の負荷により発現が抑制された (Figure 5a, c, e, g)。次に血管石灰化の重要なプロセスであるアポトーシスへの IS、 Notch シグナルの影響を caspase3/7 活性、Tunel 染色にて評価した。Aortic SMCs に ISを負荷すると、濃度、時間依存的に、caspase3/7 活性の上昇、Tunel 陽性細胞の増加を認めた (Figure 6a-d)。Aortic SMCs に Notch シグナルの阻害剤である DAPT を負荷しても同様の結果となり、IS、Notch シグナルの低下はいずれもアポトーシスを誘導する事が示唆された (Figure 6e-h)。
　次に IS の負荷、Notch シグナルの抑制が血管石灰化を促進するか検討するために、カルシウム沈着の評価を行った。Aortic SMCs への IS の負荷、DAPT による Notch シグナルの抑制は、いずれもカルシウム沈着を増加させるが、アポトーシスの阻害剤である ZVAD を加えると、このカルシウム沈着の増加は解除された (Figure 7a,b)。これらの結果から、インドキシル硫酸の負荷、Notch シグナルの抑制によるアポトーシスの誘導は、大動脈の石灰化に関与している事が示唆された。最後に、Notch1、Notch3のどちらが血管石灰化に関与しているかを検討するために siRNA を使用しそれぞれれのノックダウンを行い、Notch 関連分子、石灰化関連分子の発現を評価した。Notch1、 Notch3 をシングルノックダウンするとそれぞれ約 50%抑制され、redundancy を認めなかった (Figure 7c, d)。Notch1 をノックダウンすると、下流転写因子の Hes-1、Hey-1が抑制され、Runx2、OPN の発現が亢進した (Figure 7e, f, g, i)。Notch3 をノックダウンすると、Hey-1 が抑制され、BMPs2 と OCN の発現が亢進した (Figure 7f, h, j)。一方 Notch1、Notch3 のノックダウンはいずれも SM22 の発現を抑制した (Figure 7k)。 Notch1 と Notch3 のダブルノックダウンでは、それらの相乗効果を認めた (Figure 7e- k)。これらの結果から、Notch1 と Notch3 の阻害は協調的に血管平滑筋の分化転換を誘導していると考えられた。

【考察】
　本研究における主要な知見は以下である。
(1) IS は、高血圧ラットの大動脈における中膜石灰化を促進した。
(2) IS は、高血圧ラットの大動脈中膜、及び冠動脈周囲での Notch シグナル活性を抑制した。
(3) IS は、大動脈平滑筋細胞の骨芽細胞型への分化転換を促進した。
(4) IS は、大動脈平滑筋細胞での Notch シグナル活性を一過性に亢進するが、長時間の負荷により抑制された。
(5) IS は、大動脈平滑筋細胞におけるアポトーシスを誘導し、カルシウム沈着を亢進させた。薬剤的な Notch シグナルの阻害においても、同様の結果を示した。
(6) Notch1 と Notch3 は、協調的に血管平滑筋の骨芽細胞型への分化誘導を促進した。これらの結果により、IS は大動脈における Notch シグナルを抑制し、大動脈平滑筋細胞の骨芽細胞型への分化誘導を行う事により、石灰化を促進する事が示された。またその機序として、IS による Notch シグナルの抑制がアポトーシスを亢進し、石灰化を誘導する事が示された。本研究により、インドキシル硫酸による Notch シグナルの抑制は、CKD 患者の重要な生命予後因子である血管石灰化において重要な役割を担う事が示された。

【結論】
　IS は大動脈における Notch 活性を抑制し、骨分化およびアポトーシスを亢進する事により血管石灰化を促進する事が示唆された。Notch シグナルは CKD 患者における血管石灰化において、有効な治療標的となりうる事が期待される。

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参考文献

1. Henaut L, Mary A, Chillon JM, Kamel S, Massy ZA. The Impact of Uremic Toxins on Vascular Smooth Muscle Cell Function. Toxins. 2018; 10.

2. Furusawa K, Takeshita K, Suzuki S, Tatami Y, Morimoto R, Okumura T, et al. Assessment of abdominal aortic calcification by computed tomography for prediction of latent left ventricular stiffness and future cardiovascular risk in pre-dialysis patients with chronic kidney disease: A single center cross-sectional study. International journal of medical sciences. 2019; 16: 939-48.

3. Sato B, Yoshikawa D, Ishii H, Kikuchi R, Arima T, Takeshita K, et al. Indoxyl sulfate, a uremic toxin, and carotid intima-media thickness in patients with coronary artery disease. International journal of cardiology. 2013; 163: 214-6.

4. Baeten JT, Lilly B. Notch Signaling in Vascular Smooth Muscle Cells. Advances in pharmacology. 2017; 78: 351-82.

5. Radtke F, Wilson A, Mancini SJ, MacDonald HR. Notch regulation of lymphocyte development and function. Nature immunology. 2004; 5: 247-53.

6. Takeshita K, Satoh M, Ii M, Silver M, Limbourg FP, Mukai Y, et al. Critical role of endothelial Notch1 signaling in postnatal angiogenesis. Circulation research. 2007; 100: 70-8.

7. Kikuchi R, Takeshita K, Uchida Y, Kondo M, Cheng XW, Nakayama T, et al. Pitavastatin-induced angiogenesis and arteriogenesis is mediated by Notch1 in a murine hindlimb ischemia model without induction of VEGF. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 2011; 91: 691-703.

8. Li Y, Takeshita K, Liu PY, Satoh M, Oyama N, Mukai Y, et al. Smooth muscle Notch1 mediates neointimal formation after vascular injury. Circulation. 2009; 119: 2686-92.

9. Fischer A, Schumacher N, Maier M, Sendtner M, Gessler M. The Notch target genes Hey1 and Hey2 are required for embryonic vascular development. Genes & development. 2004; 18: 901-11.

10. Tamai H, Kobayashi M, Takeshita K, Kodama A, Banno H, Narita H, et al. Possible involvement of Notch signaling in the pathogenesis of Buerger's disease. Surgery today. 2014; 44: 307-13.

11. Shang Y, Smith S, Hu X. Role of Notch signaling in regulating innate immunity and inflammation in health and disease. Protein & cell. 2016; 7: 159-74.

12. Niwa T. Targeting protein-bound uremic toxins in chronic kidney disease. Expert opinion on therapeutic targets. 2013; 17: 1287-301.

13. Leopold JA. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends in cardiovascular medicine. 2015; 25: 267-74.

14. Zamurovic N, Cappellen D, Rohner D, Susa M. Coordinated activation of notch, Wnt, and transforming growth factor-beta signaling pathways in bone morphogenic protein 2-induced osteogenesis. Notch target gene Hey1 inhibits mineralization and Runx2 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 2004; 279: 37704-15.

15. Tang Z, Wei J, Yu Y, Zhang J, Liu L, Tang W, et al. gamma-Secretase inhibitor reverts the Notch signaling attenuation of osteogenic differentiation in aged bone marrow mesenchymal stem cells. Cell biology international. 2016; 40: 439-47.

16. Harrison OJ, Visan AC, Moorjani N, Modi A, Salhiyyah K, Torrens C, et al. Defective NOTCH signaling drives increased vascular smooth muscle cell apoptosis and contractile differentiation in bicuspid aortic valve aortopathy: A review of the evidence and future directions. Trends in cardiovascular medicine. 2019; 29: 61-8.

17. Garg V, Muth AN, Ransom JF, Schluterman MK, Barnes R, King IN, et al. Mutations in NOTCH1 cause aortic valve disease. Nature. 2005; 437: 270-4.

18. Adijiang A, Goto S, Uramoto S, Nishijima F, Niwa T. Indoxyl sulphate promotes aortic calcification with expression of osteoblast-specific proteins in hypertensive rats. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association. 2008; 23: 1892-901.

19. Niwa T, Takeda N, Tatematsu A, Maeda K. Accumulation of indoxyl sulfate, an inhibitor of drug-binding, in uremic serum as demonstrated by internal-surface reversed-phase liquid chromatography. Clinical chemistry. 1988; 34: 2264-7.

20. Yisireyili M, Takeshita K, Hayashi M, Wu H, Uchida Y, Yamamoto K, et al. Dipeptidyl peptidase- IV inhibitor alogliptin improves stress-induced insulin resistance and prothrombotic state in a murine model. Psychoneuroendocrinology. 2016; 73: 186-95.

21. Aoyama T, Takeshita K, Kikuchi R, Yamamoto K, Cheng XW, Liao JK, et al. gamma-Secretase inhibitor reduces diet-induced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Biochemical and biophysical research communications. 2009; 383: 216-21.

22. Uchida Y, Takeshita K, Yamamoto K, Kikuchi R, Nakayama T, Nomura M, et al. Stress augments insulin resistance and prothrombotic state: role of visceral adipose-derived monocyte chemoattractant protein-1. Diabetes. 2012; 61: 1552-61.

23. Chen NX, O'Neill KD, Duan D, Moe SM. Phosphorus and uremic serum up-regulate osteopontin expression in vascular smooth muscle cells. Kidney international. 2002; 62: 1724-31.

24. McCullough PA, Agrawal V, Danielewicz E, Abela GS. Accelerated atherosclerotic calcification and Monckeberg's sclerosis: a continuum of advanced vascular pathology in chronic kidney disease. Clinical journal of the American Society of Nephrology : CJASN. 2008; 3: 1585-98.

25. Lanzer P, Boehm M, Sorribas V, Thiriet M, Janzen J, Zeller T, et al. Medial vascular calcification revisited: review and perspectives. European heart journal. 2014; 35: 1515-25.

26. Billaud M, Hill JC, Richards TD, Gleason TG, Phillippi JA. Medial Hypoxia and Adventitial Vasa Vasorum Remodeling in Human Ascending Aortic Aneurysm. Frontiers in cardiovascular medicine. 2018; 5: 124.

27. Asai H, Hirata J, Hirano A, Hirai K, Seki S, Watanabe-Akanuma M. Activation of aryl hydrocarbon receptor mediates suppression of hypoxia-inducible factor-dependent erythropoietin expression by indoxyl sulfate. American journal of physiology Cell physiology. 2016; 310: C142-50.

28. Landor SK, Lendahl U. The interplay between the cellular hypoxic response and Notch signaling. Experimental cell research. 2017; 356: 146-51.

29. Garg V. Notch Signaling in Aortic Valve Development and Disease. In: Nakanishi T, Markwald RR, Baldwin HS, Keller BB, Srivastava D, Yamagishi H, editors. Etiology and Morphogenesis of Congenital Heart Disease: From Gene Function and Cellular Interaction to Morphology. Tokyo; 2016. p. 371-6.

30. Hilton MJ, Tu X, Wu X, Bai S, Zhao H, Kobayashi T, et al. Notch signaling maintains bone marrow mesenchymal progenitors by suppressing osteoblast differentiation. Nature medicine. 2008; 14: 306-14.

31. Yao XX, Lu JB, Ye ZD, Zheng L, Wang Q, Lin ZQ, et al. Hairy/enhancer of Split Homologue-1 Suppresses Vascular Endothelial Growth Factor-induced Angiogenesis via Downregulation of Osteopontin Expression. 2017; 7: 898.

32. Wang H, Jiang Z, Zhang J, Xie Z, Wang Y, Yang G. Enhanced osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells on titanium substrates by inhibiting Notch3. Archives of oral biology. 2017; 80: 34-40.

33. Doi H, Iso T, Sato H, Yamazaki M, Matsui H, Tanaka T, et al. Jagged1-selective notch signaling induces smooth muscle differentiation via a RBP-Jkappa-dependent pathway. The journal of biological chemistry. 2006; 281: 28555-64.

34. High FA, Lu MM, Pear WS, Loomes KM, Kaestner KH, Epstein JA. Endothelial expression of the Notch ligand Jagged1 is required for vascular smooth muscle development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008; 105: 1955-9.

35. Bosse K, Hans CP, Zhao N, Koenig SN, Huang N, Guggilam A, et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 2013; 60: 27-35.

36. Niwa T, Shimizu H. Indoxyl sulfate induces nephrovascular senescence. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 2012; 22: 102-6.

37. Zeng C, Xing R, Liu J, Xing F. Role of CSL-dependent and independent Notch signaling pathways in cell apoptosis. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 2016; 21: 1-12.

38. Gao H, Liu S. Role of uremic toxin indoxyl sulfate in the progression of cardiovascular disease. Life sciences. 2017; 185: 23-9.

39. Lehto S, Niskanen L, Suhonen M, Ronnemaa T, Laakso M. Medial artery calcification. A neglected harbinger of cardiovascular complications in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 1996; 16: 978-83.

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