論文の公開元へPromethazine downregulates Wnt/β-catenin signaling and increases biomechanical forces of injured Achilles tendon
概要
【緒言】
アキレス腱断裂は、年間10万人あたり18～31人の頻度で発生し、その頻度は増加傾向にある。損傷すると適切な生物学的および生体力学的特性で損傷前と同様の機能を取り戻すことはできない。腱修復を促進するために、胚性幹細胞、骨髄由来間質細胞などの移植や、成長因子の投与が実験レベルで行われている。しかし、腱の修復を促す薬剤は報告されていない。
コラーゲンなどの腱関連細胞外マトリックスは、分化した腱細胞から分泌されるが、これは転写因子であるscleraxis(Scx)とmohawk(Mkx)によって促進されている。Scxは腱細胞の適切な分化に必要な初期マーカー、Mkxは腱細胞におけるI型コラーゲン生成を制御する腱細胞の初期成熟マーカーである。細胞外マトリックスタンパク質の制御因子であるテノモジュリン(Tnmd)は、コラーゲン線維の成熟に必要な腱の発達を示す後期マーカーである。
Wnt/β-cateninシグナルは、様々な組織で組織の治癒と再生に関与している。Wnt/β-cateninシグナル活性化すると、β-cateninの安定化と核内移行が促進され、標的遺伝子が活性化される。以前、我々は活性化したWnt/β-cateninシグナルを特異的阻害剤であるIWR-1で抑制すると、Scx、Mkx、Tnmdの遺伝子発現を誘導することを報告した。しかし、損傷した腱組織におけるWnt/β-cateninシグナル伝達の役割についてはほとんど知られていない。
一方、私たちはプロメタジン(PH)が骨格筋の血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)陽性間葉系幹細胞の脂肪細胞分化を抑制することを明らかにした。PHは、EthopropazineやHydroxyzineを含む第一世代の抗ヒスタミン剤の一つで、PHとEthopropazineは、Phenotiazineの誘導体である。PHは、抗ドーパミン作用、抗ヒスタミン作用、抗コリン作用を持ち、大きな副作用なくアレルギー、不眠症、吐き気の治療に使用されている。
本研究では、損傷した腱におけるWnt/β-cateninシグナルの活性化について解析し、IWR-1とPHによるWnt/β-cateninシグナルの阻害が腱治癒に及ぼす影響について検討した。
【方法】
ラットの右アキレス腱をパンチで損傷し、左の腱は偽手術を行った。術後0.5(3日)、1、2、3、4、8週で、両側のアキレス腱を採取し切片を作成した。各時期での、Wnt/β-cateninシグナルの活性化をβ-cateninの免疫染色を用いて評価した。また、術後2週で引っ張り強度測定器を用いて、生体力学的特性を評価した。
ラットのアキレス腱を用いてプライマリーカルチャーを行い、腱由来細胞(TDC)を分離した。TDCにPHやPHの類似薬剤、Wnt/β-cateninシグナル刺激剤やTGF-β、BMPの阻害剤を投与し、PCRで腱関連遺伝子やWnt/β-cateninシグナル下流のAxin2に与える影響を確認した。
腱損傷を行ったラットにWnt/β-catenin阻害剤IWR-1と抗ヒスタミン剤PHを術後2週間、それぞれ局所および筋肉内に注射した。術後2週間と8週間で修復腱を採取し、その組織学的および生体力学的特性を評価した。
【結果】
ラットの損傷腱において、術後1、2週時点でWnt/β-cateninシグナルの活性化を認めた。また術後2週で、損傷側は偽手術側に比較してPeakForce、Stiffness、PeakStress、ElasticModulusが有意に低下し、Crosssectionalareaが増加した(Fig.1)。
腱損傷ラットへのIWR-1投与により、腱内のWnt/β-cateninシグナルは抑制され、組織学的には改善された。一方で生体力学的特性はVehicle投与と比較して悪化する傾向にあった(Fig.2)。
次に、抗ヒスタミン薬であるPHのTDCに対する効果を検討した。PHの骨格であるPhenotiazine、類似の構造を持つEthopropazine、同じく第一世代の抗ヒスタミン薬であるHydroxyzineと異なり、Axin2の発現を抑制し、Mkx、Tnmdの発現を亢進させた。また、PHはAxin2を濃度依存的に抑制し、Mkxを濃度依存的に亢進させた。Tnmdに対しては濃度依存性を認めなかったが、1μMをピークに発現を亢進させた(Fig.3)。
腱損傷ラットへのPH投与では、組織学的な改善は認めなかった。一方、損傷腱のβ-cateninを減少させ、術後2週目の修復腱のPeak ForceとStiffnessも有意に増加させた(Fig.4)。しかし、術後8週目には、有意差は減少していた。
【考察】
腱修復におけるWnt/β-cateninシグナルの役割についてはほとんど知られていなかった。本研究では、腱損傷後2週間、組織にムコ多糖が異常に蓄積している時期(Fig.1A)に、腱細胞でWnt/β-cateninシグナルが活性化していることを見出した(Fig.1B-D)。また、Wnt/β-cateninシグナル阻害剤であるIWR-1を腱損傷2週間後に局所投与すると、ムコ多糖の蓄積(Fig.2A)とBonarスコアの改善が見られた(Fig.2B)。Wnt/β-cateninシグナルは腱損傷後2週間活性化され、損傷部位のムコ多糖類を含む細胞外マトリックスを増加させると考えられる。IWR-1の投与により、損傷腱と偽手術した両方の腱において生体力学的特性が損なわれた(Fig.2E)。IWR-1は治療目的で開発された薬剤ではないため、Wnt/β-cateninシグナル伝達阻害作用を持つ薬物をFDA既認可薬より探索した。
TDCにおいてWnt/β-cateninシグナルに対する抗ヒスタミン剤の抑制効果について検討した。その結果、PHは、TDCのWnt/β-cateninシグナルを抑制することがわかった。しかし、Ethopropazine、Phenotiazine、Hydroxyzineでは同様の効果は見られなかった(Fig.3A,B)。また、PHはTDCにおいてMkxとTnmdの両方の発現を著しく増加させた(Fig.3C)。PHはTGF-βシグナルを直接増強しなかったが(Fig.3E)、PHが誘導するMkxとTnmdの発現増加にはTGF-βシグナルが必要であることも見出した(Fig.3D)。PHがどのようにWnt/β-cateninシグナルを介してMkxとTnmdの発現を制御しているのかを理解するためには、さらなる研究が必要である。
ラットの腱損傷モデルにおいて、PHの筋肉内注射が、損傷後2週間にはWnt/β-cateninシグナルを有意に減少させ(Fig.4C、D)、修復したアキレス腱の生体力学的特性の改善を促進することを示している(Fig.4E)が、8週間後には差が消失していた。PHは腱の早期治癒を促進し、腱修復の治療薬となる可能性が示された。
【結論】
IWR-1とプロメタジンはともにWnt/β-cateninシグナルを抑制し、治癒した腱の組織学的異常を改善した。しかし、IWR-1は治癒した腱の生体力学的特性を低下させたが、プロメタジンはそれを改善した。
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