論文の公開元へ非全身曝露型化合物を指向した腸管NaPi阻害薬の創製
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非全身曝露型化合物を指向した腸管NaPi阻害薬の創製
前本, 道寛
北海道大学. 博士(薬科学) 甲第15320号
2023-03-23
10.14943/doctoral.k15320
http://hdl.handle.net/2115/89899
theses (doctoral)
Michihiro_Maemoto.pdf
Instructions for use
Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
博士学位論文
非全身曝露型化合物を指向した
腸管 NaPi 阻害薬の創製
前本
道寛
北海道大学大学院生命科学院
生命科学専攻 生命医薬科学コース
創薬有機化学研究室
令和 5 年 3 月
目次
略語表
緒言 ...........................................................................................................................1
第１章
1.1
リード化合物の創出と最適化研究 .......................................................6
低膜透過性 NaPi2b 阻害薬としてのテトラヒドロチエノピリジン誘導体 7 の
同定............................................................................................................................... 6
1.2
肺への化合物分布低減に向けた塩基性低減展開 .................................................. 9
1.3
両性イオン体 15 の薬物動態 .................................................................................. 15
1.4
両性イオン体 15 の腸管ループ試験 ...................................................................... 16
第２章
アシルヒドラゾン構造からの脱却 .....................................................19
2.1
アシルヒドラゾン構造を回避した誘導体展開戦略 ............................................ 19
2.2
非アシルヒドラゾン構造であるアニリド誘導体の取得.................................... 20
2.3
上部ベンゼン環へのヘテロ環導入による構造活性相関.................................... 22
2.4
両性イオン体 30 の創製 .......................................................................................... 23
2.5
両性イオン体 30 を用いたラットにおけるリン酸塩吸収阻害作用評価.......... 26
第３章
化合物の合成 .........................................................................................30
3.1
化合物 4−15 の合成 .................................................................................................. 30
3.2
化合物 16−30 の合成 ................................................................................................ 35
結論 .........................................................................................................................44
試験方法 .................................................................................................................46
実験項 .....................................................................................................................51
謝辞 .......................................................................................................................101
参考文献 ...............................................................................................................102
略語表
本報では以下の略語を用いた。
CKD: chronic kidney disease
DMA: N,N-dimethylacetamide
ESRD: end-stage renal disease
FGF23: fibroblast growth factor 23
HBA: H-bond acceptor
HBD: H-bond donor
HEPES: 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid
HMDS: 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazane
HPLC: high-performance liquid chromatography
IPA: isopropyl alcohol
IS: internal standard
LC: lanthanum carbonate
MES: 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
Ms: methanesulfonyl
MW: molecular weight
NaH: sodium hydride
NaI: sodium iodide
NaPi2b: sodium-dependent phosphate transport protein 2b
nROT: number of rotatable bonds
PAMPA: parallel artificial membrane permeability assay
PBS: phosphate-buffered saline
PEG: polyethylene glycol
PTH: parathyroid hormone
Ro5: rule of 5
SD: Sprague-Dawley
SH: sevelamer hydrochloride
SLC: solute carrier
TEA: triethylamine
TFA: trifluoroacetic acid
TFAA: trifluoroacetic anhydride
tPSA: topological polar surface area
緒言
リン酸塩は生体内で最も豊富な化学種の 1 つであり、骨、歯、細胞膜および核酸の必要
不可欠な構成成分である。加えて、細胞内シグナル伝達の調節、組織におけるエネルギー
産生、そして生体内 pH の維持に不可欠である。1-3 したがって、適切な生体内リン酸塩濃
度の維持は、恒常性のために非常に重要である。生体内リン酸塩濃度は、食事に由来する
無機リン酸塩の腸管からの取り込み、骨と軟部組織間での交換、腎臓での再吸収と排出、
および消化管からの便を介した排泄によって一定の範囲に保たれている。4, 5
腸管からのリン酸塩の吸収機構に関しては完全には解明されていないものの、二つの独
立した経路を介していると広く認識されている。一つはナトリウム依存的な能動経路であ
り、溶質キャリア（solute carrier, SLC）トランスポーターであるナトリウム依存性リン酸ト
ランスポーター2b（sodium-dependent phosphate transport protein 2b, NaPi2b; SLC34A2）
、Pit1
（SLC20A1）
、そして Pit2（SLC20A2）を介した取り込みが知られている。もう一つはナト
リウム非依存的な細胞間隙を介した受動輸送である。6 一方で、NaPi2b コンディショナル
ノックアウトマウスにおいては、Pit1 および Pit2 を介した腸管からのリン酸塩の吸収はほ
とんどないと報告されており、能動輸送には、NaPi2b が大きく関与していると推察されて
いる。7
NaPi2 ファミリーを介したリン酸塩の恒常性の制御について、Figure 1 に示す。NaPi2 フ
ァミリーは、NaPi2a（SLC34A1）
、NaPi2b および NaPi2c（SLC34A3）の 3 種類で構成されて
おり、いずれもリン酸塩の恒常性の維持に重要な役割を果たしている。これらのうち、NaPi2a
および NaPi2c は、主に腎臓の近位尿細管の頂端膜側に発現しており、糸球体濾液からの無
機リン酸塩の再吸収を担っている。一方、NaPi2b は小腸の頂端膜側に発現しており、食事
性無機リン酸塩の吸収を担っている。8 これらのトランスポーターの発現にはいくつかのホ
ルモンが関わっている。NaPi2a および NaPi2c は、線維芽細胞増殖因子 23（fibroblast growth
factor 23, FGF23）および副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone, PTH）によって発現抑制さ
1
れ、近位尿細管における無機リン酸塩の再吸収抑制に伴い、尿中への無機リン酸塩の分泌を
増加させる。9, 10 一方で、NaPi2b は 1,25(OH)2-ビタミン D3 によって発現亢進され、腸から
の食事性無機リン酸塩の吸収を増加させる。9, 10
Figure 1. Diagram of phosphate homeostasis. The secretion of FGF23 and PTH is increased in
response to high serum phosphate levels, and renal phosphate excretion is increased due to the
downregulated expression of NaPi2a and NaPi2c. On the other hand, 1,25(OH) 2D3 is increased at low
phosphate serum levels, which upregulates NaPi2b expression and increases intestinal phosphate
absorption.9,
10
Reprinted with permission from reference.11 Copyright 2022 American Chemical
Society.
慢性腎臓病（Chronic kidney disease, CKD）が進行すると骨・ミネラルの代謝異常が起こ
り、その病態は CKD-mineral and bone disorder と呼ばれている。12 多くの研究において、
CKD 患者における血清リン酸塩濃度の上昇は、心血管疾患および死亡リスクの上昇に繋
がることが示唆されている。13-17 それゆえ、CKD 患者、特に末期腎不全患者（end-stage renal
disease, ESRD）においては、リン制限食事療法や透析により過剰なリン酸塩を低減し、血
清リン酸塩濃度を正常に保つことが重要である。18 これらに加えて、食事から得られる過
剰な無機リン酸塩の吸収を妨げる治療薬として、塩酸セベラマーや炭酸ランタンなどの経
口リン酸塩吸着剤が末期腎不全患者に使用されている。19-21 しかしながら、経口リン酸塩
吸着剤は 1 日の服薬量が多いことや（炭酸ランタン：0.5－4.5 g/day、塩酸セベラマー：0.4
－9.6 g/day）
、CKD 患者は処方されている薬剤数が多い傾向があることから、服薬アドヒ
アランスの低下を招いている。22 これに加え、経口リン酸塩吸着剤による下痢や便秘など
2
の消化管に対する副作用も大きな課題である。23-27
これらの課題に対し、筆者は腸管からの食事性無機リン酸塩の吸収を阻害する低分子薬
の開発を目指した。すなわち、高用量の服薬を回避し、また経口リン酸塩吸着剤の有する副
作用を示さない低分子高リン血症治療薬の創製に取り組んだ。先述の通り、腸管に発現して
いる NaPi2b は食事性無機リン酸塩の吸収に大きく関与していることから、腸管の NaPi2b を
阻害する治療薬は、経口リン酸塩吸着剤よりも低用量で血清リン酸塩濃度の低下が期待で
きると考えた。7, 28 一方で、NaPi2b は腸管だけでなく肺や精巣にも発現しており、NaPi2b 遺
伝子の変異は肺胞小石症や精巣小石症に関連していると報告されている。29-31 それゆえ、血
中曝露型aの NaPi2b 阻害薬を用いた際には、異所性石灰化のようなオンターゲットの副作用
が懸念される。31
これまでに、NaPi2a もしくは NaPi2b 阻害薬として化合物 1, 2 が報告されている（Figure
2）
。32-35 NaPi2a 阻害薬 1（IC50 = 380 nM）は、NaPi2b に対する親和性と比較して 65 倍以上
の NaPi2a 選択性を示しており、その誘導体はヒト近位尿細管細胞においてリン酸塩の取り
込み阻害を示している。一方で、in vivo におけるリン酸塩取り込み阻害活性は報告されてい
ない。NaPi2b 阻害薬 2（IC50 = 120 nM）は、ラットにおいて、十二指腸内投与（10 mg/kg）
で、門脈における食事性無機リン酸塩の吸収抑制を示した最初の化合物である。しかしなが
ら、化合物 2 の膜透過性や経口吸収性については報告されていない。
Figure 2. Chemical structures of the reported NaPi inhibitors.
Reprinted with permission from reference.11 Copyright 2022 American Chemical Society.
a 経口投与により腸管から吸収されて、全身に分布する。
3
高リン血症治療薬の開発を目指した創薬において、
能動輸送経路の阻害薬である ASP3325
（構造不明）や EOS789、受動輸送経路の阻害薬である Tenapanor を用いた腸管からの食事
性無機リン酸塩吸収阻害薬の臨床試験が報告されている（Figure 3）。36-39 ASP3325 は、血中
曝露型 NaPi2b 阻害薬であり、アデニン誘発性腎不全モデルラットおよび高リン酸塩食を与
えた正常ラットに対する経口投与試験において、血清リン酸塩濃度の低減に有効であるこ
とと安全性が確認されている。しかしながら、ESRD 患者において、経口投与による血清リ
ン酸塩濃度の低下は確認できなかった。38 EOS789 は、低吸収性を示すリン酸トランスポー
ター阻害薬であり、経口投与によって健康なボランティアおよび血液透析患者の糞便中リ
ン酸塩排泄量を有意に増加させた。37 Tenapanor は、腸管からほとんど吸収されない非血中
曝露型の Na+/H+交換輸送体 3（sodium-hydrogen exchanger 3, NHE3）阻害薬であり、経口投
与によって ESRD 患者の血清リン酸塩濃度を有意に低下させた。39 最近の高リン血症治療
薬の臨床開発動向から、NaPi2b 阻害薬以外の作用機序の研究も実施されてきているものの、
依然として経口リン酸塩吸着剤が高リン血症治療薬として唯一の臨床使用可能な治療薬で
ある。
Figure 3. Chemical structures of phosphate absorption inhibitors.
以上の研究動向を考慮し、筆者は、経口リン酸塩吸着剤に比べて低用量かつ副作用の懸念
なく使用できる高リン血症治療は、経口吸収されて血中に分布することなく腸管局所で作
4
用する強力なリン酸塩取り込み阻害活性を示す NaPi2b 阻害薬により実現できるのではない
かと考え、創薬研究を実施した。本論文において、スクリーニングヒット化合物 3 からのリ
ード化合物の創出、副作用抑制を目的とした肺移行性低減のための構造最適化、副作用が懸
念されるアシルヒドラゾン構造回避に向けた誘導体展開、および in vivo でのリン酸塩吸収
阻害作用に関して報告する。
5
第１章
1.1
リード化合物の創出と最適化研究
低膜透過性 NaPi2b 阻害薬としてのテトラヒドロチエノピリジン誘導体 7
の同定
NaPi2b は腸管の頂端膜側に主に発現している。それゆえ、非血中曝露型の化合物であっ
ても腸管の NaPi2b に作用することが可能であり、十分なリン酸塩吸収阻害活性を示すこと
が可能であろうと推測した。7, 8 筆者は、非経口吸収性を示す腸管の NaPi2b 選択的阻害薬の
取得に向けた手法として、膜透過性を限りなく下げることによりバイオアベイラビリティ
を低減させる戦略を取ることとした。リード化合物取得に向けて、ヒト NaPi2b 発現
KJMGER8 細胞 40 を作製し、33P-ラジオ標識リン酸塩の取り込み測定によるスクリーニング
を行った。協和キリンの化合物ライブラリーの中から、化合物 3（IC50 = 87 nM）41 が非常に
強いリン酸塩取り込み阻害活性を示すヒット化合物として取得された。ヒト NaPi2b 非発現
KJMGER8 細胞においては、化合物 3 によるリン酸塩吸収取り込み阻害活性は観察されてな
い。化合物 3 の課題として低溶解性（0.1 μM in PBS at pH 7.4）があることから、溶解性向上
に向け化合物に極性官能基を導入することとした。加えて、電荷を有する官能基を導入する
ことで、脂質二重膜との親和性の低減が可能であり、結果として低膜透過性にもつながるの
ではないかと期待し、実施した。
低膜透過性かつ高溶解性の化合物の取得を目指し、化合物 3 の 4,5,6,7-テトラヒドロベン
ゾチオフェン部位（X）へシクロプロピルアミノ基を導入し、末端ベンズアミドの m 位（R）
に環状あるいは鎖状アミノ基を置換し、in vitro における NaPi2b 阻害活性、溶解性、そして
膜透過性を評価した。合成した 6-シクロプロピル-4,5,6,7-テトラヒドロチエノピリジン誘導
体と評価（リン酸塩取り込み阻害活性、溶解性、人工膜透過性）結果に関して Table 1 に示
す。報告されている NaPi2b 阻害薬である化合物 2 を陽性対照として用いた。
6
Table 1. Structure-activity relationship of 6-cyclopropyl-4,5,6,7-tetrahydrothieno[2,3-c]pyridine
and 6-hydroxy-6-methyl-4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thiophene derivatives by introducing a
basic functional group at the m-position of benzamide
NaPi2b IC50a
Sol.b
Pec
(nM)
(μM)
(10-6 cm/s)
838
1.9
2.1
87
0.1
NDe
4
455
7.9
0.12
5
404
17
0.068
6
249
45
0.068
7
354
66
0.051
8
997
82
0.26
Compound
X
R
2d
3
a
CH2
50% inhibitory concentration against H2[33P]O4 uptake in human NaPi2b-transfected KJMGER8 cells.
The values are shown as a mean of three determinations. bSolubility in PBS at pH 7.4. cPassive
permeability from the apical to basolateral direction was measured using PAMPA. dCompound 2 was
synthesized according to the literature.35 eNot determined. Reprinted with permission from reference.11
Copyright 2022 American Chemical Society.
R 部位に N-メチルジアゼピルメチル基を導入した化合物 4（IC50 = 455 nM）は、ヒット化
合物 3 と比較してリン酸塩取り込み阻害活性が 5 倍程度減弱した。一方で、溶解性は向上
した（7.9 μM in PBS）
。ピペリジン誘導体を導入した化合物 5、ピペラジン誘導体を導入し
た化合物 6 は、それぞれリン酸塩取り込み阻害活性が 3−5 倍程度減弱した（5, IC50 = 404 nM;
7
6, IC50 = 249 nM）。これら誘導体の溶解性は更に向上した（5, 17 μM in PBS; 6, 45 μM in PBS）。
プロパンジアミン鎖を導入した化合物 7 は、リン酸塩取り込み阻害活性が 4 倍程度減弱し
（IC50 = 354 nM）、溶解性は 66 μM であった。化合物の溶解性に関して、疎水性および pKa
計算値（calculated pKa, cpKa）を比較した。化合物 4 および 7 の疎水性は、逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）の保持時間から同程度であった。一方で、cpKa は化合物 7 の方
が高値を示した（4, cpKa = 8.91; 7, cpKa = 10.39）
。 ...
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