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IgAのヒト肺線維芽細胞に対する作用とその機序の解明について

荒川, さやか 東京大学 DOI:10.15083/0002002385

2021.10.13

概要

【背景】免疫グロブリン(Immunoglobulin: Ig)Aは人体で最も豊富に存在する免疫グロブリンで、IgAを産生している形質細胞は気道や腸管、尿生殖路などの外界に面した粘膜組織に多く存在する。IgAは病原微生物や侵入抗原などと接触し、外敵からの防御の最前線で重要な役割を果たす。血液中でIgAは、約90%が単量体のIgA(monomeric IgA: mIgA)として存在する一方、気道内で産生、分泌されるIgAの約半分は分泌型IgA(secretory IgA: sIgA)として存在する。sIgAはJ鎖を含む二量体IgA(dimeric IgA: dIgA)が粘膜上皮細胞の基底膜面に発現するpolymeric immunoglobulin receptor(pIgR)と結合後、細胞内の粘膜面まで輸送され、secretory component(SC)と共に切断され気道内腔、すなわち気道粘膜面に分泌される。
 IgAが感染症、アレルギー疾患、免疫異常等に対して防御的な作用を有する一方で、IgAが病態形成に関与する可能性を示す報告も複数存在する。IgAが病態形成に関与することが示唆されている疾患の1つに特発性肺線維症(Idiopathic pulumonary fibrosis: IPF)がある。IPFは発症原因が不明である特発性間質性肺炎の中でも進行性の線維化を来たす呼吸器疾患であり、極めて予後不良である。そのIPFについて、血清中の総IgA値がIPFの予後予測マーカーとして有用である可能性が報告された。
 IPFの病態形成に大きく関与している上皮間葉転換(epithelial-mesenchymal transition: EMT)の誘導に寄与しているのが肺損傷から線維化へ至る過程で重要な因子の1つであるTransforming growth factor(TGF)-βで、実は同一抗原に対する免疫グロブリンへのクラス変換、すなわちクラススイッチを介してIgAの産生にも関わる。TGF-βとその作用で誘導されるIgAの双方が、IPFの病態形成に重要な役割を果たしている可能性が考えられるが、肺線維芽細胞および筋線維芽細胞に対するIgAの作用や、IPFをはじめとした組織の線維化を来たすその他の呼吸器疾患におけるIgAの作用はほとんど解明されていない。そこで、本研究ではIgAがヒト肺線維芽細胞に及ぼす作用およびその作用機序を明らかにすることを目的とした。

【方法】NHLFsの細胞表面蛋白の発現、およびIgA結合はフローサイトメトリーで、上清中のサイトカイン濃度はCytometric Bead Assay(CBA)で測定した。IκBαとp-Erk1/2の発現はWestern blottingで、その他の細胞内蛋白発現は細胞内染色後にフローサイトメトリーで測定した。mRNA発現量は逆転写後realtimePCRを用いてサイクル比較法で相対定量した。連続変数の二群間比較はMann-Whitney’s U検定で、多群間比較はKruskal-Wallis検定で評価し、統計学的有意差はP<0.05として解析した。

【結果】購入した正常ヒト肺線維芽細胞(NHLFs)をmIgAおよびsIgAにより刺激し回収した上清をCBAおよびPCRで解析すると、mIgAではなくsIgAで刺激後の上清のタンパクおよびmRNAレベルでのIL-6、IL-8、MCP-1およびGM-CSFの産生が有意に上昇した。またこれらのサイトカイン産生はsIgAの刺激時間に応じて経時的に上昇した。またsIgA特異的な分子であるsecretory component(SC)を抗SC抗体で中和するとsIgA刺激により誘導されたNHLFsのサイトカイン産生の一部がCBAで低下し、この反応にはSCが部分的に関与していることが示唆された。
 次にsIgAによるNHLFsの重要な機能である細胞増殖能およびコラーゲンゲル収縮の変化について、既に誘導が確認されているTGF-β1を含めて確認すると、BrdUの取り込みで評価した細胞増殖能およびImage J programにより解析したコラーゲンゲル収縮はsIgA刺激によりTGF-β1と同様の傾向で促進されることが分かった。またsIgA刺激後にNHLFsの筋線維芽細胞の分化マーカーであるα-SMAおよび筋線維芽細胞が産生する細胞外基質に含まれるCollagen type Iの発現についてPCRおよびWestern blottingで評価すると、sIgA刺激によりNHLFsでのmRNAおよびタンパクでどちらも発現が増強していた。
 sIgAのNHLFsへの結合および細胞表面上に発現しているIgA受容体についてフローサイトメトリーで評価したところ、NHLFsへのsIgA結合および既報のIgA受容体のうちトランスフェリン受容体でもあるCD71が発現し、NHLFsの免疫染色でも発現を確認した。siRNAを用いてCD71をノックダウンすると、sIgA刺激により誘導されるNHLFsのサイトカイン産生の一部が低下し、sIgA結合も部分的に抑制された。
 sIgA刺激により誘導されたIL-6、IL-8、MCP-1について、炎症性サイトカイン産生に関与しているNF-κBおよびMAPKシグナルが関与しているかIκB、JNK、p38MAPK、Erk1/2のリン酸化に対する特異的阻害剤を加えた培養上清をCBAで、sIgA刺激後に回収したNHLFsのlysateを用いてNFκBの核内移行・転写活性の阻害因子であるIkBα、Erk1/2およびp-Erk1/2の発現量の変化についてWestern blottingで評価した。IκBのリン酸化に対する特異的阻害剤であるBAY11-7082およびErk1/2リン酸化特異的阻害剤であるU0126によりsIgA刺激で誘導されたNHLFsのIL-6、IL-8、MCP-1産生が低下し、Western blottingでsIgA刺激5分後から30分後にかけてNHLFsのp-Erk1/2発現が増強した。
 最後に線維芽細胞巣を含む肺線維症の組織切片を上皮細胞と間葉系細胞のマーカーとなる抗体で免疫染色を行ったところ、一部上皮細胞に覆われていない、気腔と接した線維芽細胞巣が観察された。

【考察】本研究で、sIgAの作用によりNHLFsからの産生が増強することが明らかになった複数のサイトカインは、上皮の損傷や炎症の持続により異常な組織の線維化を引き起こし、IPFを含む線維化異常による疾患の病態形成に関わり、sIgAによるNHLFsのmRNAおよびタンパクレベルでのα-SMA発現増強を示したことで、sIgAにより線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化が誘導される可能性を示した。さらにsIgAによるNHLFsの細胞増殖能、コラーゲンゲル収縮能の促進作用が、強力な線維化を引き起こすTGF-βと同様の傾向を示したことは大変興味深い。sIgAがTGF-βと同様にコラーゲンゲル収縮を促進したことから、気道局所で産生されたsIgAと線維芽細胞が反応することで炎症性サイトカイン・ケモカインや線維芽細胞、筋線維芽細胞の増殖、細胞外基質の産生が気道で促進され、IPFの病態と類似する変化を起こす可能性がある。
 血清中IgAの約90%が本研究でNHLFsの活性作用が乏しかったmIgAであるため、今回NHLFsの活性化を引き起こしたsIgAによる直接作用と結びつけて考えることは難しい。両者の人体における産生量について詳細な報告はないがsIgAを構成しているmIgAおよびdIgAはいずれも形質細胞から産生され、また炎症性疾患では血清中のsIgAが増えるという報告もあり、mIgAおよびsIgA双方には何らかの関連があると考えられる。NHLFsに対する、sIgA特異的な分子であるSCの影響をより正確に評価するためには、今回の実験に加え精製されたSCやrecombinant SC、SC欠損マウスなどを用いた確認が必要である。またsIgA刺激により誘導されるNHLFsのサイトカイン産生についてはCD71以外のIgA受容体やNF-κBのRelA/p65のアセチル化やリン酸化などを介した反応が関与しているのかについても同様に検討が必要と考えられる。
 本研究は単一の線維芽細胞株で実験を行っており、より正確な評価のために今後異なるNHLFsの細胞株や肺線維症のマウスモデル、IPF合併症例の手術検体などを用いた実験を通じてIPFを含む異常な線維化を来たす疾患の病態形成におけるsIgAの役割について考えていきたい。

【結論】生体内に最も豊富に存在するIgAの中で、sIgAが特異的にNHLFsの活性化を引き起こした。本研究ではsIgAがNHLFsのIL-6、IL-8、MCP-1およびGM-CSF産生、細胞増殖能、コラーゲンゲル収縮能を増強することが示された。また、sIgAはNHLFsにおけるColIおよび筋線維芽細胞の分化のマーカーであるα-SMAの産生を増強した。そしてsIgAは少なくとも部分的にはIgA受容体の1つであるCD71を介してNHLFsと結合し、NHLFsの活性化を誘導していると考えられた。またsIgA特異的であるSCやErk1/2のリン酸化を介したMAPKシグナルがNHLFsのサイトカイン産生誘導に関与していることが示唆された。本研究によりsIgAがNHLFsの活性化に重要な役割を果たす可能性が示されたが、今後よりIPFの病態に近い細胞やマウスを用いたさらなる検証が必要と考えられる。

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