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Nrf2/Keap1経路の活性化による酸化ストレスの減少が卵巣の抗加齢に及ぼす影響の検討

秋野, なな 東京大学 DOI:10.15083/0002002450

2021.10.15

概要

近年本邦において、女性の社会進出に伴い晩婚化が進行しており、今後もさらに晩婚化、少子化、出生年時齢の上昇は進行すると考えられ、これに伴い不妊に悩むカップルは増加している。
　女性は35歳を境に妊孕性が急激に低下することが知られているが、その大きな要因として酸化ストレスなどの蓄積による卵巣の加齢が挙げられる。卵巣の加齢の大きな原因となる酸化ストレスを減じることで、卵巣の加齢を遅らせることが妊孕性の温存に有用であると考え、重要な抗酸化経路であるNuclear factor-E2-related factor 2(Nrf2)/Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)-antioxidant response element(ARE)に着目した。Nrf2/Keap1経路が適切に機能することで生体は酸化ストレスから防御されており、発癌や糖尿病、神経疾患との関連も近年わかってきた。
　過剰な酸化ストレスは卵巣を加齢させることで不妊に繋がる一方で、適切な量の酸化ストレスは卵胞の発育や排卵に不可欠であると考えられており、酸化ストレスのレベルを適切にマネージメントすることは有用であると考えられる。そこでNrf2/Keap1経路の活性化が酸化ストレスを減弱させ、加齢による不妊を遅らせることにつながるかを、ヒト卵巣顆粒膜細胞とマウス卵巣において以下の方法で検討した。

1. ヒト黄体化顆粒膜細胞
　体外受精の採卵時に回収した卵胞液からヒト黄体化顆粒膜細胞（GC）を単離培養し、過酸化水素またはNrf2/Keap1経路を活性化させる試薬Dimethylfumarate(DMF)により刺激した。またNrf2特異的siRNAを用いて内在性Nrf2をノックダウンした。その後、定量的RT−PCR法またはWestern blottingに供した。

2. ヒト卵巣組織免疫染色法
　免疫組織化学染色用として、子宮頸癌もしくは子宮内膜癌のため摘出された、病理学的に正常なヒト卵巣組織切片を用いた。パラフィン切片を作成し、一次抗体として抗-Nrf2抗体と抗-Keap1抗体を用いて染色した。

3. マウス採卵、卵巣、血清採取
　20週齢のBALB/c雌マウスを32週まで飼育し、DMFの卵巣への効果を調べるためにDMF群とControl群（各15匹）の2群に分け、DMF群には20㎎/kgのDMFを0.1ml、Control群には0.1%メチルセルロースを0.1ml、それぞれ32週から48週まで16週間連日経口投与した後に排卵誘発を行い、採卵、両側卵巣摘出と心臓採血を施行した。

4. マウス卵巣組織免疫染色とTUNEL染色
　3.で摘出した卵巣組織をパラフィン包埋し、組織免疫染色を行った。HE染色連続標本を用いて卵胞数を計測し、残りの切片を用いて一次抗体として抗-Nrf2抗体と抗-Human8-hydroxy-2'-desoxyguanosine(8-OHdG)抗体を用いて染色した。またアポトーシスの過程で生じる断片化DNAをTUNEL染色により検出した。

5. RNA抽出及び定量的PCR
　1. で得られたGC、及び3.で摘出したマウス卵巣からRNAを抽出し、定量的PCRを行った。ヒトNrf2、ヒトCatalase、ヒトSOD1、ヒト8-oxoguanineDNA-glycosylase1(OGG1)、マウスNrf2、マウスCatalase、マウスSOD1、マウスNAD(P)Hquinonedehydrogenase1（NQO1）の発現を評価した。

6. Western blotting
　1. で得られたGC、及び3.で摘出したマウス卵巣からタンパクを抽出し、一次抗体として抗-Nrf2、抗-Keap1、抗-Catalase、抗-SOD1、抗-OGG1、抗-NQO1、と抗-telomerase reverse transcriptase(TERT)を用いて各タンパク量を検出した。

7. 細胞蛍光免疫染色法と細胞内ROSの計測
　1. で得られたGCに対して、抗-Nrf2抗体、抗-8-OHdG抗体で反応させ、蛍光標識二次抗体で染色し共焦点顕微鏡で観察した。また、細胞内ROSをfluoroprobe carboxymethyl-H2-dichlorofluorescein diacetate(CM-H2DCFDA; Invitrogen)染色を用いて、共焦点顕微鏡で観察し蛍光強度を計測した。

8. ELISA法
　ELISA法を用いて、3．で得られたマウス血清の抗ミュラー管ホルモン（anti-mullerian hormone；AMH）とNrf2の濃度を測定した。

9. 統計学的解析
　統計学的解析はJMP Pro 11 softwareを用いて行った。データは最低限3回の実験結果の平均値及び標準誤差値で記載し、2群比較はStudent t testで、多重比較はTukey-Kramer HSD testにて解析を行い、P<0.05を有意とした。
　上記の方法により下記の結果を得られた。

1. ヒト卵巣におけるNrf2及びKeap1タンパクの発現
　組織免疫染色法を用いて様々な発育段階の卵胞を抗-Nrf2抗体と抗⁻Keap1抗体で染色した結果、各発育段階の卵胞においてGCの細胞質を中心にNrf2とKeap1タンパクの発現が確認された。

2. 酸化ストレス刺激はヒト顆粒膜細胞においてNrf2及び抗酸化物質の発現を上昇させる
　GCにおいて酸化ストレスがNrf2及び抗酸化物質の発現に及ぼす影響を検討するために、培養GC細胞に酸化ストレス刺激を与えた。過酸化水素（200µm、400µm、600µm）をそれぞれ培養液に添加して培養刺激し、定量的RT−PCR法またはWestern blottingに供した。その結果、定量的RT−PCR法において過酸化水素刺激は濃度依存性にNrf2、Catalase、SOD1、OGG1のmRNA発現を上昇させ、600µmの過酸化水素刺激では有意な上昇がみられた。Western blottingによる解析でも濃度依存性にNrf2,Catalase、SOD1、OGG1のタンパク発現量を上昇させ、Keap1はタンパク発現量の低下が観察された。

3. 内因性Nrf2のノックダウンはヒト顆粒膜細胞での抗酸化物質の発現を低下させる
　SiRNAを用いてヒトGCの内因性Nrf2をノックダウンし、定量的RT−PCR法またはWestern blottingによりNrf2、及び抗酸化物質の発現量を検討した結果、Catalase、SOD1、OGG1のmRNA発現量は有意に減少することが観察された。また、Western blottingによる解析でも内因性Nrf2のノックダウンはCatalase、SOD1、OGG1のタンパク発現量を低下させ、Keap1タンパクは発現量が上昇した。

4. Nrf2活性化剤DMFによるヒト顆粒膜細胞刺激は抗酸化物質の発現を上昇させる
　GCにDMF（50µm、100µm）を添加し、定量的RT−PCR法またはWestern blottingによりNrf2、及び抗酸化物質の発現量を検討した結果、100µmのDMF刺激はNrf2、Catalase、SOD1、OGG1のmRNA発現量を有意に上昇させ、Nrf2、Catalase、SOD1、OGG1のタンパク発現量も増加した。DMF刺激によりKeap1タンパクの発現量は低下した

5. ヒト顆粒膜細胞におけるNrf2の活性化は8-OHdG産生とROS産生を低下させる
　GCをそれぞれDMFまたは過酸化水素で刺激し、抗-Nrf2抗体または抗-8-OHdG抗体で反応させ、蛍光免疫染色法で検討を行った結果、DMF刺激を与えたGCはNrf2の蛍光強度が上昇し、8-OHdGの蛍光強度は低下し、過酸化水素刺激を与えたGCは8-OHdGの蛍光強度が上昇したことから、DMFによるNrf2の活性化は酸化ストレスの軽減に寄与することが示唆された。
　またGC内ROSをCM-H2DCFDA染色を用いて計測した結果、DMFによる刺激はControlに比べROS産生を1/3程度に有意に減少させ、反対に過酸化水素刺激はROS産生を増加させた。

6. マウスへのDMF投与は排卵数と貯蔵原始卵胞数を増加させた
　マウスへのDMF投与は、DMF群に対してControl群で有意な排卵数の増加が見られた。また、卵巣組織のHE染色でDMF群とControl群の原始卵胞、一次卵胞、二次卵胞、胞状卵胞の数をそれぞれ計測した結果、一次卵胞、二次卵胞、胞状では有意差は見られなかったが、原始卵胞では約60%多くの卵胞がDMF群で観察された。

7. DMF投与で血清中Nrf2とAMH濃度は上昇した
　マウスへのDMF投与により、ELISA法で血清中のNrf2とAMHの濃度は有意な上昇を認めた。

8. DMF投与によりNrf2は活性化し、抗酸化物質の産生は上昇した
　マウスへのDMF投与によりmRNA発現量はNrf2、Catalase、SOD1、NQO1とそれぞれ有意に上昇し、Western blottingによるタンパクの発現量もそれぞれ上昇がみられた。Keap1のタンパク発現量は反対に低下した。

9. DMF投与は卵巣組織での酸化ストレスを軽減した
　卵巣組織免疫染色でNrf2と、酸化ストレスマーカーである8-OHdGのタンパク発現量を検討した結果、DMF投与によりNrf2は発現の上昇を認め、反対に8-OHdGは発現が減少した。またTUNEL染色では、DMF投与によりTUNEL陽性細胞は減少した。

10. TelomereとTERT活性はDMF投与で上昇した
　DMF投与によるTelomereとTERTのmRNA発現量の変化を測定した結果、Telomere、TERTともにmRNAは有意に発現が上昇し、TERTのタンパク発現量も上昇を認めた。
　以上より下記のように考察された。
　女性不妊の原因として酸化ストレスの影響は大きいと広く考えられており、代表的な抗酸化経路であるNrf2/Keap1経路の活性化がヒト及びマウス卵巣において酸化ストレスを軽減するかを検討した。
　ヒト顆粒膜細胞において、Nrf2活性化剤DMFによる刺激はNrf2及び抗酸化物質の発現を上昇させ、8-OHdGとROS産生を低下させた。またマウスへのDMF経口投与は排卵数と貯蔵原始卵胞数を有意に増加させ、卵巣組織での酸化ストレスの軽減がみられた。以上より、DMFによるNrf2/Keap1経路の活性化は抗酸化物質の発現が上昇することにより酸化ストレスを減少させ、卵巣の加齢を遅らせる可能性が示された。現在、多発性硬化症の治療でDMFを経口投与されている東京大学医学部附属病院の生殖年齢にある女性患者の卵巣機能を追跡しており、今後は卵巣予備能の指標として血中のAMHやNrf2の値を測定する予定である。

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