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Degradation of Mutant Protein Aggregates within the Endoplasmic Reticulum of Vasopressin Neurons

宮田, 崇 名古屋大学

2021.04.23

概要

【緒言】
　小胞体（ER）は分泌タンパクおよび膜タンパクの折りたたみを担う細胞内小器官である。一方で、種々の要因により正常な構造に折りたたまれなかった異常タンパクがERに蓄積するとERストレスが生じる。ERストレスは神経変性疾患や糖尿病を始めとした多くの疾患の病態に関与している。一般にERに蓄積した異常タンパクはユビキチン-プロテアソーム系（UPS）によるER関連分解（ERAD）あるいはER-phagyにより分解されるが、いずれも異常タンパクをERから細胞質へ輸送あるいは隔離した後に分解が行われる。その一方で、ER内で凝集体を形成しERから細胞質へ輸送隔離されることのできなくなった異常タンパクに対してどのような分解機構が働くかは未だ明らかとなっていない。家族性中枢性尿崩症（FNDI）は、生後数ヶ月から数年で緩徐に進行する尿崩症症状を呈する常染色体優性遺伝性疾患であり、バソプレシン（AVP）ニューロンのERに変異ニューロフィジンII（NPII）が蓄積することによるERストレスが病態の主体である。我々はFNDIモデルマウスを作出しAVPニューロンのERの一部に凝集体が隔離された区画（ER-associated compartment: ERAC）が形成されることを見出し、さらにはERAC形成がERストレスを緩和する細胞保護的な機構であることを明らかにしてきた。ERストレスが病態に関与する他の疾患モデルでもFNDIマウスと同様にERACの形成が報告されていることから、ERACの形成は普遍的な機構であると考えられる。その一方で、ERAC内の異常タンパクの分解機構は未だ不明であり、その機序の解明はERストレス応答のさらなる理解に繋がると考えられる。

【目的】
　AVPニューロンにおける異常タンパク凝集体の分解機構を解明する。

【方法】
　（1）FNDIマウスの視索上核（SON）において、連続ブロック表面走査電子顕微鏡（SBF-SEM)を用いてAVPニューロンにおけるERACと周囲のオルガネラとの構造的関係性を解析した。（2）FNDIマウスのAVPニューロンにおいて、変異NPIIと正常NPII、ERシャペロンBiPおよびライソソーム関連分子LAMP2、cathepsin Dの細胞内局在を蛍光免染および免疫電顕により検討した。また、FNDI×GFP-LC3マウスを作出し、ファゴフォアのマーカーであるGFP-LC3の発現を、同じく蛍光免染および免疫電顕にて観察した。（3）FNDIマウスにオートファジー誘導薬のラパマイシン（Rapa）あるいはライソソーム阻害薬のクロロキン（CQ）を腹腔内注射にて１ヶ月間投与し、SONにおける封入体の数の変化を免疫組織化学にて検討した。

【結果】
　（1）SBF-SEMの解析により、FNDIマウスのAVPニューロンにおいてERACは小さな突起構造を有していることが観察された（図1A）。そのERACの突起構造と正常ERの連続性が確認され（図1B,C）、さらにはERACへのライソソームの融合が観察された（図1D,E）。（2）FNDIマウスの蛍光免染および免疫電顕において、変異NPIIがERAC内あるいはER内の凝集体に確認された一方で、正常NPIIは分泌顆粒内に認められた（図2A-G）。下垂体後葉では変異NPIIは確認されず、正常NPIIの発現のみが認められた（図2H,I）。また、ERACの膜構造にBiPの集積を認めた（図3A-E）。FNDI×GFP-LC3マウスの解析において、ERACの膜構造にGFP-LC3の発現が認められた（図3F-I）。さらにはERAC内にLAMP2、cathepsin Dが確認された（図4）。（3）ERACの数はRapa投与により有意に減少し、一方でCQ投与により有意に増加した（図5）。

【考察】
　ERACは、α1アンチトリプシン欠損症、ニューロセルピン封入体脳症、セイピノパチー、常染色体優性網膜色素変性症などの疾患モデルでも確認されている。これまでERACと正常ERとの連続性は明らかとされていなかったが、本研究でSBF-SEMを用いることによってその連続性が詳細に示された。
　免疫電顕による検討において、変異NPIIは分泌顆粒内には認められずERAC内に封じ込められていた。この結果は、様々なAVP遺伝子変異から生じた変異AVP前駆体がER内に蓄積しているという過去のin vivoおよびin vitroの結果と一致していると考えられた。
　今回の研究で、ERACはBiPおよびLC3が発現する膜に囲まれていること、ERACへのライソソームの融合しておりERAC内部にライソソーム関連分子が発現していること、さらには薬理学的解析によりERAC内の凝集体はライソソームによる分解を受けていることが示された。このER内部におけるライソソームによる分解（ERAC degradation）とmacro-ER-phagyの違いは、macro-ER-phagyではER内の異常タンパクはERの一部とともにファゴフォアで完全に隔離された後にライソソームが融合して分解している一方で、ERAC degradationではER内の異常タンパクはERから隔離されずにERの内部でライソソームにより分解されるという点である。また、ERACはSBF-SEMで電子密度の高い膜構造に囲まれており、またこの膜構造は免疫電顕においてLC3の発現が確認されていることから、ERACはファゴフォアの特徴を持つ膜構造に囲まれていると考えられ、この点においてERAC degradationはmicro-ER-phagyとも異なっている。以上のことから、ER内に蓄積した異常タンパクがER内部で分解されることが本研究において初めて示されたと言える。しかしながら、ERAC degradationにおいて、変異NPIIと同様にライソソームの加水分解酵素であるcathepsin DがERAC内に封じ込められ正常ERに広がっていかないメカニズムに関しては明らかとなっておらず、今後解明すべき課題である。
　過去に当研究グループの解析より、自由飲水下のFNDIマウスのAVPニューロンにおいては変異NPIIがERACに封じ込められている限りAVPニューロンにおいてmacro-ER-phagyおよび細胞死が誘導されない一方で、間歇脱水負荷を継続して与えたFNDIマウスのAVPニューロンでは変異NPIIの凝集体がER内腔全体に散らばり、やがてはオートファジー関連細胞死へ至ることが報告されている。以上を踏まえると、ERACの形成と同様にERAC degradationは、AVPニューロンを細胞死から保護するために必要不可欠なメカニズムであると考えられる。
　AVPニューロンにおいて、野生型AVP前駆体はUPSによる分解を受けることが報告されている。さらに最近の研究では、ERADにおけるE3リガーゼであるSel1L-Hrd1タンパク複合体を欠損させるとAVPニューロンのERにおいて著しい拡張ならびに野生型AVP前駆体の凝集体が蓄積し、AVP欠乏のために多尿を呈することが報告された。これらの報告からはERADがAVPニューロンの細胞機能の維持に必要不可欠であるといえるが、一方で本研究の結果は、AVPニューロンにおいて異常タンパク凝集体をERから細胞質へ輸送することなくER内部で分解するというERADとは別のメカニズムが存在することを示している。

【結語】
　FNDIマウスのAVPニューロンにおいて、ER内で凝集体を形成した異常タンパクは、ERから輸送隔離されることなく、ER内部でライソソームにより分解されていることが示された。

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