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A novel renal perivascular mesenchymal cell subset gives rise to fibroblasts distinct from classic myofibroblasts

湊口, 俊 名古屋大学

2022.12.22

概要

【緒言】腎線維化は腎不全の進行に大きく寄与することが広く知られている。腎線維化には主に腎間質の間葉系細胞、特に筋線維芽細胞(Myofibroblasts)が関与することが知られているが、近年の研究ではPericyteを含む血管周囲間葉系細胞(Perivascular mesenchymal cell: PMC)が腎障害時に活性化されMyofibroblastに分化し、線維化の中心的な役割を担っていることが報告されている。PMCのマーカー分子としてGli1、Pdgfr-β、Ng2などが知られているが、PMCがさまざまな細胞より構成されたヘテロな細胞集団であるために、それぞれの細胞についての理解は十分ではない。

我々は、これまでに骨髄間葉系幹細胞の新規マーカーであるMeflinを同定し、Meflinが心臓、膵癌組織、肺においてFibroblastに発現し、線維化を抑制する分子であることを報告している。また、腸管や骨格筋の再生にも関与していることも近年の研究より明らかになっている。しかしながら、腎臓におけるMeflinに関する知見は得られていない。そこで今回我々は、Meflin分子およびMeflin陽性細胞の挙動・機能についての研究を行った。

【方法】
まず我々は、野生型マウス腎とヒト腎生検検体に対するIn situhy bridization、およびMeflinレポーターマウス(Meflin-CreERT2; Rosa26-LSL-td Tomatomマウス)を使用して、正常腎組織におけるMeflinの局在を評価した。またマウス腎の透明化手法を用いて三次元的にMeflin陽性細胞を評価した。さらに、Meflinレポーター下にジフテリアトキシンレセプター(DTR)を発現させたマウス(Meflin-DTRマウス)にジフテリア毒素を投与して、正常腎におけるMeflin陽性細胞を除去することでMeflin陽性細胞の機能を分析した。また糸球体血管極周囲のMeflin陽性細胞の機能を調べるために、Meflinレポーターマウスに対して減塩餌およびカプトプリル投与を行い、レニン分泌を誘導するモデルを作成した。

次に、障害腎におけるMeflinおよびMeflin陽性細胞の挙動を調べるためにマウス腎線維化モデルとしてUUO(片側尿管結紮)モデルを使用した。野生型マウスおよびMeflinレポーターマウスに対してUUO手術を行い、経時的なMeflinの変動およびMeflin陽性細胞の挙動の変化を分析した。また、腎障害時におけるMeflin陽性細胞の機能を調べるために、UUO手術後にジフテリア毒素を投与しMeflin陽性細胞除去を誘導したマウス腎組織を分析した。さらに、ヒト腎組織におけるMeflinの発現量と腎線維化の関係を調べるために、IgA腎症患者の腎生検組織を使用してMeflinの免疫染色を行い、発現量と線維化の程度および腎予後の関係について評価した。細胞レベルでのMeflinを評価するために、ラット腎線維芽細胞(NRK49F細胞)を使用しTGF-β刺激を行った際のMeflinの発現を評価した。また、NRK49F細胞に対してMeflinを強制発現させ、TGF-βおよびBMP7刺激を行った際の変化を分析した。

【結果】
野生型マウス腎とヒト腎生検検体に対するIn situhy bridization、およびMeflinレポーターマウスの腎組織の解析により、Meflinが主に腎臓間質および血管周囲に限局して存在することを見出した。また、マウス腎の透明化手法を用いてMeflin陽性細胞が特に糸球体血管極周囲および輸入細動脈より中枢の動脈血管周囲に局在していることを明らかにした。Meflin-DTRマウスにジフテリア毒素を投与して正常腎におけるMeflin陽性細胞を除去したところ、血管壁の著明な菲薄化、内腔の拡張、および腎組織におけるα-SMA、Col1a1の増加を認めた。また、糸球体血管極のMeflin陽性細胞は一部がレニン分泌にも関与していることを同定した。

次に、UUOモデルを用いて腎障害時におけるMeflinの挙動を解析したところ、Meflinは障害早期から著明な増加を認めた。また、MeflinレポーターマウスにUUO手術を行った実験では、Meflin陽性細胞が腎障害発生後、徐々に血管から離脱し間質で分枝しながら増殖していくことを同定した。さらに、増殖したMeflin陽性細胞は間質で活発なコラーゲン産生をしていることも同定した。UUO手術による腎障害発生後にジフテリア毒素によるMeflin陽性細胞除去を誘導したマウスでは、腎組織におけるCol1a1mRNAおよびCol3a1mRNAの有意な発現低下を認めた。IgA腎症患者の腎生検検体を用いた解析においても、Meflinの発現量は腎線維化と有意に相関しており、長期的な腎予後とも有意な関連を認めた。

しかしながら、腎障害時におけるMeflinの発現分布は、線維化促進性Myofibroblastsのマーカーとして知られるα-SMAとは異なる分布を示しており、Meflin陽性細胞が従来の線維化促進性Myofibroblastsとは異なる細胞集団であることを示唆していた。細胞実験においても、ラット腎線維芽細胞(NRK49F細胞)にTGF-β刺激を行った際に、α-SMAが上昇するのに対し、Meflinの発現は低下しており、Meflinとα-SMAの挙動が大きく異なることを確認している。同細胞に対してMeflin分子を強制発現させた細胞では、TGF-β刺激に対する線維化マーカーの反応が抑制され、α-SMAおよびVimentinの上昇が抑えられた。また、抗線維化作用を有するBMP7刺激を行ったところ、Meflin強制発現細胞においてBMP7のターゲット遺伝子であるId1の有意な上昇を確認した。

【考察】
正常腎組織におけるMeflinおよびMeflin陽性細胞の分析結果は、Meflin陽性細胞が構造的にも機能的にもPMCの重要な細胞集団(サブグループ)であることを示唆していた。また、腎障害時にMeflin陽性細胞が血管を離脱して形態変化しながら増殖していく現象やヒト腎生検組織を用いた解析でMeflinの発現が腎線維化や腎予後と有意に関連していた点は、Meflin陽性細胞が腎障害後の線維化形成の過程に関与していることを強く示唆していた。一方で障害腎におけるMeflinの発現はα-SMAとは異なる分布を示しており、Meflin陽性細胞が従来のMyofibroblastsとは異なる線維芽細胞に分化する細胞集団であることを示唆していた。細胞実験の結果は、Meflinが分子レベルでは抗線維化作用を有することを示していた。

【結論】
本研究では、Meflinが腎臓におけるPMCの新規サブグループのマーカーになりうることを示した。腎障害時にはMeflin陽性細胞が血管周囲から離脱しながら増殖・分化するが、その分布は従来のα-SMA陽性Myofibroblastsとは異なっていた。Meflinは抗線維化作用を持つ分子であり、腎臓の線維化、組織修復の過程に寄与することが示唆された。

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