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A further study on a disturbance of intestinal epithelial cell population and kinetics in APC1638T mice

WENDUERMA 岐阜大学

2021.03.25

概要

【緒言】
　Adenomatous polyposis coli(APC)は大腸癌抑制遺伝子として知られている。APCタンパク質にはいくつかの機能ドメインがあり，そこに様々なタンパク質が結合し，APCの多彩な機能が生じると考えられている。APC1638T/1638T変異マウス(APC1638Tマウス)はAPCのC末端が欠損した変異APCタンパク質を発現する。APC1638Tマウスでは腫瘍は発生せず，APC+/+mice(WTマウス)と同じく天寿をまっとうするため，成体を用いた解析が可能である。本研究では，以前から知られている腸絨毛の伸長を引きおこすAPC1638Tマウス腸上皮の恒常性異常を追究した。

【対象と方法】
8-12週齢のAPC1638TマウスとWTマウスを以下の実験に用いた。
①体重および小腸の長さ(十二指腸∼回腸)を測定し，小腸組織のヘマトキシレン•エオジン染色切片を顕微鏡で観察した。
②24時間で食べた餌の量と体重増加率を算出した。
③血中アミラーゼ，リパーゼ，グルコース，総コレステロールの量を検査した。
④腸幹細胞系(Lgr5陽性幹細胞，Bmi1陽性幹細胞，CD133/prom1陽性前駆細胞)を，それぞれのマーカーにより免疫染色した。細胞増殖マーカーであるKi-67の免疫染色によって，増殖細胞を検出した。腸幹細胞恒常性に関連しているシグナルである，Wnt/β-cateninシグナル，BMPシグナル，MAPKシグナル，hippo-YAP-TAZシグナル，Notchシグナル，Hedgehogシグナルの状態を，ウエスタンブロッティング法とRT-PCR法で調べた。
⑤Glycoprotein2(GP2)免疫染色により，空腸と回腸のmicrofoldcells(M細胞)を検出した。RT-PCR法を用いてM細胞のマーカー遺伝子であるGp2およびM細胞の分化に関連する遺伝子であるMarcksl1とSpibの空腸におけるmRNAの発現レベルを調べた。
⑥Cleaved caspase-3を用いてアポトーシス細胞を精査し，RT-PCR法でアポトーシス制御に関与するBcl2，Bax遺伝子のmRNA発現レベルを確認した。
⑦免疫染色によりE-cadherinの局在を観察し，ウエスタンブロッティング法を用いてE-cadherinタンパク質の発現量を調べた。さらに，Cleaved caspase-3とE-cadherinを二重免疫染色し，アポトーシス細胞とE-cadherin発現との関連を詳細に追究した。

【結果】
①APC1638Tマウスの体重は有意に少なく，小腸の長さ(十二指腸∼回腸)は有意に短く，空腸の陰窩-絨毛長が有意に伸長していた。十二指腸と回腸の陰窩-絨毛長には有意差はなかった。
②APC1638Tマウスの食物摂取量と体重増加率は，WTマウスと比べて差がなかった。
③APC1638Tマウスの血中アミラーゼ，リパーゼ，グルコース，総コレステロール値はWTマウスと比べて有意差を認めなかった。
④APC1638Tマウスの腸幹細胞系である，Lgr5陽性幹細胞，Bmi1陽性幹細胞，CD133/prom1陽性前駆細胞の数はWTマウスと比べて有意差がなかった。APC1638Tマウスの空腸におけるKi-67陽性細胞の数は，WTマウスと比べて有意差がなかった。さらに，APC1638Tマウス空腸ではWnt/β-cateninシグナル，BMPシグナル，MAPKシグナル，hippo-YAP-TAZシグナル，Notchシグナル，Hedgehogシグナルの変化は認められなかった。
⑤APC1638Tマウス空腸では，WTマウスと比べて，絨毛M細胞の数は有意に多かった。Gp2とSpibのmRNA発現レベルは有意に高かったが，Marcksl1のmRNA発現レベルはWTマウスと比べて差がなかった。WTマウスとAPC1638Tマウスの回腸に絨毛M細胞は存在しなかったが，パイエル板M細胞が観察された。APC1638Tマウス回腸のパイエル板M細胞はWTマウスと比べて有意に少なかった。
⑥APC1638Tマウス空腸では，絨毛先端のCleavedcaspase-3陽性細胞はWTマウスと比べて有意に多いが，Bcl2とBaxのmRNA発現レベルに有意差はなかった。
⑦APC1638Tマウス空腸では，E-cadherinの発現と局在はWTマウスと比べて差はなかったが，絨毛先端の脱落しかかっているアポトーシス細胞の側面のE-cadherinの染色性はWTマウスと比べて強かった。

【考察】
　APC1638Tマウスの小腸上皮細胞の増殖と分化に関連している主なシグナル系を調べた結果，その活性に異常を認めなかったが，空腸の絨毛M細胞が有意に多く，M細胞分化因子であるSpibのmRNA発現レベルも有意に高かった。従って，APC1638Tマウス空腸ではM細胞の増殖・分化が促進している可能性がある。APC1638Tマウスでは絨毛先端の脱落しかかっているアポトーシス細胞の側面のE-cadherinの染色性はWTマウスと比べて強く，絨毛先端アポトーシス細胞の脱落抑制が起こっている可能性がある。

【結論】
　APC1638Tマウス空腸ではM細胞の分化促進と絨毛先端アポトーシス細胞の脱落抑制が腸絨毛の伸長に関係している可能性が示唆された。

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