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細胞老化に伴うインターフェロン誘導遺伝子の発現制御機構

山上, まり 東京大学 DOI:10.15083/0002005036

2022.06.22

概要

日本をはじめ世界中で高齢化が深刻な問題となっている。加齢は、様々な疾患の重大なリスクファクターであり、高齢社会においていかに健康長寿を目指すかは社会全体の課題といえる。そしてそのために老化や老化関連疾患の生理的メカニズムを解明することが今まさに求められている。

ヒトの正常な組織から取り出した体細胞は、ある一定回数細胞分裂を繰り返すと、増殖を停止する。この現象は細胞老化と呼ばれている。継代培養による複製老化のほか、がん遺伝子の活性化や酸化ストレスなど、様々なDNAダメージよっても細胞は増殖を停止することが報告されており、これらはストレス誘導性細胞老化と呼ばれている。細胞老化はDNAダメージをうけた細胞が危険な細胞増殖にいたるのを防いでいるため、重要ながん抑制機構であると考えられている。一方で、老化細胞が細胞老化随伴分泌現象（SASP）を引き起こし、炎症や腫瘍形成を促進することで、生体の機能低下や老化関連疾患の発症に関与している可能性が示唆されている。老化細胞の機能は徐々に明らかになりつつあるが、いまだ不明な点も多く残されている。

今回我々は継代培養によりヒト皮膚線維芽細胞(NHDF）を複製老化させ、cDNAマイクロアレイで老化細胞と非老化細胞の網羅的mRNA発現の比較を行った。すると、老化細胞では多数のIFN誘導遺伝子（ISGs）の発現が増加していた。しかし驚くべきことにIFNファミリー自体の発現は増加していなかった。定量PCRでも検証したが、結果は同様で、老化細胞ではIL6やISGsの著明な発現増加を認める一方、IFNA1、IFNB1の明らかな増加はなかった。

ISGsは、細胞がウイルスなどの侵入を受けた際に、インターフェロン(IFN)により誘導される遺伝子群で、様々な免疫応答に関与している。IFNが細胞膜上の受容体であるIFN受容体に結合すると、そこに結合しているJAK1、TYK2がリン酸化され、細胞内のsignal transducer and activator of transcription 1 (STAT1)およびSTAT2をリン酸化する。リン酸化したSTAT1、STAT2は二量体を形成し、IFN regulatory factor9(IRF9)と結合してISGfactor3(ISGF3)と呼ばれる複合体を形成し核内に移行する。ISGF3はISGsのプロモーター領域に存在するIFN応答配列（ISRE）に結合しISGsの転写を誘導する。上記が典型的なIFN刺激を伴うJAK-STAT経路であるが、近年IFN非依存的に発現しているISGsの機能が報告されている。恒常的なISGsの発現はウイルス感染時の迅速な免疫応答に重要であるという報告や、その一方で、異常高発現は腫瘍形成促進や抗ウイルス療法への抵抗性など、負の効果をもたらすことも示唆されている。IFN非存在下にISGsの恒常的発現が引き起こされる機序として、非リン酸化STATsを伴う非リン酸化ISGF3によって誘導されることが一部のオルガノイドやがん細胞において報告されている。

本研究では、複製老化させた老化線維芽細胞では非老化細胞に比べ、ISGsの発現が増加していた。その一方で、IFNの発現は増加していないことに気づいたことから、老化細胞におけるISGsの発現もIFN非依存的に非リン酸化ISGF3により誘導されているのではないかという仮説を立てて検討を行った。

ISGsは通常、リン酸化ISGF3が核内に移行することで誘導されるため、免疫細胞染色で、STAT1、STAT2、IRF9の細胞内局在を検証した。すると、老化細胞ではいずれも有意に核内に移行していた。Western blottingでSTATsのリン酸化について検討すると、老化細胞ではSTAT1、STAT2の発現が増加していたが、リン酸化STATsは検出されなかった。リン酸化抗体では検出できないチロシン残基以外のリン酸化の有無を検証するためPhos-tagアッセイを行ったがやはり老化細胞特異的なリン酸化STATsの増加はなかった。

次に老化細胞において、非リン酸化STAT１、STAT2がISGF3を形成し、ISGsの発現を誘導しているか検証するため、免疫沈降とChIPアッセイを行った。抗IRF9抗体を用いた免疫沈降で、老化細胞ではIRF9がSTAT1、STAT2と複合体を形成していることが示された。ChIPアッセイでは、抗IRF9抗体で落としたDNAで定量PCRを行うと、老化細胞においてISGsであるIFI27、Mx1のプロモーター領域が増幅された。以上より、老化細胞では非リン酸化ISGF3がISGsを誘導していることが示された。

続いて、NHDFでの結果の再現性を検証するために早老症の一つであるWerner症候群から抽出した線維芽細胞で同様の実験をおこなった。Werner症候群はWRN遺伝子の変異で生じる常染色体劣性遺伝の早老症の１つで、WRN遺伝子がDNAの修復や複製などに関与していることから、Werner症候群の線維芽細胞は、早期に細胞老化をきたすと考えられている。実際に、Werner症候群の線維芽細胞ではSA-β-gal活性やp16INK4Aなどの発現が増加しており、細胞老化をきたしていた。STAT１、STAT2、IRF9の免疫細胞染色を行うと、Werner症候群ではそれらが核内に移行していた。定量PCRでは老化NHDFと同様に、IFNA1、IFNB1の明らかな発現増加はないにもかかわらず、ISGsが高発現していた。Western blottingでSTATsのリン酸化を検証するとSTAT1、STAT2ともに発現が増加している一方で、リン酸化体は検出されなかった。以上よりWerner症候群においても、非リン酸化ISGF3によりISGsの発現が誘導されていることが示唆された。

次に、老化細胞におけるISGs発現がJAK-STAT経路とは独立しているかどうか検証するため、STATsの上流の主要キナーゼであるJAK1の関与について検討することとした。shRNAを用いて老化NHDFのJAK1、STAT1、STAT2をそれぞれノックダウンし、ISREによりルシフェラーゼ発現が誘導されるレポーターコンストラクトを用いてレポーターアッセイを行った。すると、JAK１をノックダウンした老化細胞では、明らかなルシフェラーゼ活性の低下を示さないのに対し、STAT1、STAT2をノックダウンした群では、ルシフェラーゼ活性の低下を認めた、これは、老化細胞でのISRE活性にSTATsのリン酸化は関与しないことを示しており、老化細胞でのISGs誘導がJAK-STAT経路から独立していることが示唆された。またそれぞれのノックダウン群でWestern blottingと定量PCRを行うと、予想通り、STAT1、STAT2のノックダウン群ではISGsの発現が減少しているのに対し、JAK1のノックダウンでは有意なISGsの発現低下はなかった。これらの結果から、老化細胞でのISGsの発現は、STAT1、STAT2は関与しているが、JAK1とは独立していることが示された。

上記のinvitroで観察されたことのin vivoでの検討として、肝組織アレイを用いてSTAT1、STAT2の免疫組織染色を行い、年齢によってSTATsの発現に違いがあるか検証した。30歳代までの若年患者と、55歳以上の高齢患者を比較すると、STAT1は肝実質細胞では有意差を認めなかったが、肝星細胞では高齢患者で発現が有意に増加していた。STAT2は、高齢患者の肝実質細胞と肝星細胞の両方で、発現が増加していた。これらの結果は、ヒトの特定の細胞内で、加齢とともにSTAT1、STAT2の発現が増加していることを示唆しており、本研究で示したようなISGsの発現に関与している可能性がある。

一方で最近、老化細胞において、核DNAやレトロトランスポゾン由来のcDNAが細胞質内で増加し、cGAS-STING経路を介して、IFNの発現を誘導していることが報告されている。これらの結果はIFN発現が増加している点で本研究の結果とは異なっている。しかし、老化細胞は細胞増殖を停止してから多段階のステップで多様化していくことが報告されており、本実験で使用した老化細胞は比較的早期の老化現象を見ている可能性がある。したがって、今回見出した細胞老化に伴うISGsの誘導機構は細胞や臓器ごと、またDNAダメージの種類ごとに、詳細な検討が必要と考える。さらに本研究では主にリン酸化STATについて検討したが、リン酸化以外のSTATの変化の有無や、非リン酸化STATが増えるメカニズム、さらに非リン酸化ISGF3がどのように核へ移行するかについても、今後解明すべき課題といえる。

上述したように、本研究では、老化細胞においてIFN非依存的にISGsの発現が増加しており、その機序として、非リン酸化ISGF3が核内に移行し、ISGsの発現を誘導していることを見出した。これは、老化細胞における、新規のISGs発現誘導機構である。非リン酸化STATsのさらなる機能解明は、老化や老化関連疾患を理解するうえでの一助となるかもしれない。

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