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A humanized MDCK cell line for the efficient isolation and propagation of human influenza viruses

髙田, 光輔 東京大学 DOI:10.15083/0002004981

2022.06.22

概要

冬季にヒトの間で流行する季節性インフルエンザウイルスは、その性状が頻繁に変化する。中でもA/H3N2亜型の季節性ウイルスは、他の季節性ウイルス〔2009年にパンデミックを起こしたA/H1N1亜型ウイルス（A/H1N1pdm）とB型ウイルス〕に比べて抗原性が変化しやすいため、流行頻度が高く、時に大規模な流行を引き起こすことがある。世界各国のサーベイランス機関は、毎冬流行する季節性ウイルスの抗原性状や抗インフルエンザ薬に対する感受性を把握し、その性状変化を監視するために、毎年膨大な数のウイルス株を分析している。

インフルエンザウイルスは、その粒子表面に存在するヘマグルチニン（HA）を使って宿主細胞表面のレセプターに結合し感染を開始する。季節性ウイルスのHAはシアル酸がガラクトースにα2,6結合した糖鎖（ヒト型レセプター）を、鳥から分離されたウイルスのHAはシアル酸がガラクトースにα2,3結合した糖鎖（鳥型レセプター）を、特異的に認識することが知られている。インフルエンザウイルスの分離と増殖には、両レセプターを発現するイヌ腎由来のMDCK細胞が広く使用されている。しかし、最近のA/H3N2流行株はMDCK細胞では効率よく増えないこと、さらに、同細胞でA/H3N2流行株を分離・継代すると、ウイルスの主要抗原であるHAや抗インフルエンザ薬の標的蛋白質であるノイラミニダーゼ（NA）に変異が生じることが報告されている。また、α2,6シアル酸を高発現するMDCK（MDCK-SIAT1やAX4）を用いてA/H3N2株を分離しても同様の変異が起きることが示されている。したがって、このような培養細胞への馴化に関わる変異を持ったウイルスでは、抗原性状や抗インフルエンザ薬に対する感受性を正確に評価することができない。

季節性ウイルスが感染増殖するヒトの上気道では、α2,6シアル酸が主に発現していることが明らかにされている。そこで本研究では、ヒト上気道上皮細胞のシアル酸レセプター発現パターンを模範したヒト化MDCK細胞を樹立し、その季節性ウイルス感染に対する感受性を解析した。

MDCK細胞は糖鎖末端にα2,3シアル酸を付加する7種類のα2,3シアル酸転移酵素遺伝子を有している。CRISPR-Cas9システムを用いて、これらの遺伝子をノックアウトした細胞の作出を試みた。はじめに各遺伝子を標的とするガイドRNAとCas9ヌクレアーゼを発現するプラスミドをMDCK細胞に導入した。さらに、この細胞にヒト由来のα2,6シアル酸転移酵素遺伝子発現プラスミドを導入した後、薬剤選別により変異MDCK細胞（hCK）を単離した。

hCK細胞表面のシアル酸発現量を調べるために、α2,3シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチン(MALII)とα2,6シアル酸糖鎖に特異的に結合するレクチン(SNA）を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。hCK細胞表面上のα2,3シアル酸量は元のMDCK細胞やAX4細胞に比べて顕著に低かったが、α2,6シアル酸量はMDCK細胞よりも高かった（図1）。

hCK細胞における季節性ウイルス（A/H1N1pdm、A/H3N2、B型）の増殖効率をMDCK並びにAX4細胞と比較した。hCK細胞におけるA/H1N1pdmとB型ウイルスの増殖効率はMDCK及びAX4細胞とほぼ同程度であったが、A/H3N2ウイルスの増殖効率はMDCKとAX4細胞に比べて顕著に高かった（図2）。さらに、インフルエンザ患者から採取した臨床検体を用いて、hCK細胞の季節性ウイルス感染に対する感受性をAX4細胞と比較した。その結果、A/H1N1pdmとB型ウイルス感染に対するhCK細胞の感受性はAX4細胞と同じであったが、A/H3N2ウイルス感染に対するhCK細胞の感受性はAX4細胞よりも顕著に高いことがわかった（図3）。さらに、hCK細胞を用いて臨床検体から分離したA/H3N2ウイルスのHAとNA遺伝子には、変異がほぼ認められなかったのに対し、MDCKあるいはAX4細胞で分離したウイルスには高い頻度で変異が見つかった。

hCK細胞で継代培養したA/H3N2ウイルスの遺伝的安定性を調べるために、同細胞で10回継代したA/H3N2ウイルスのHAおよびNAのアミノ酸配列を臨床検体中のウイルスと比較した。hCK細胞で10回継代した3株について解析したところ、1株でHAの幹部領域に変異がみられたが、残りの2株は変異が認められなかった（図４）。HA分子は立体構造上、球状頭部領域と幹部領域に分けられ、このうち球状頭部領域には、宿主の中和抗体が認識する主要な抗原決定基が存在する。AX4細胞で継代したウイルス2株において、HAの球状頭部領域あるいはNAのシアリダーゼ活性部位に変異が認められた。このようにhCK細胞で継代培養したA/H3N2ウイルスは高い遺伝的安定性を示した。

本研究において、変異が入ることなく季節性インフルエンザウイルスを効率よく分離培養できる培養細胞株（hCK）を作出した。hCK細胞で分離培養した流行株を解析することで、その抗原性状や抗インフルエンザ薬に対する感受性の変化を正確に把握することが可能になった。

以上の成績は、hCK細胞がインフルエンザウイルス研究並びにワクチン製造にとって、非常に有用な細胞であることを示している。

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