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MITOLはRMDN3/PTPIP51のホスファチジン酸結合活性を制御する

伊藤  直樹 東京薬科大学

2022.03.18

概要

【背景と目的】
 ミトコンドリアの機能維持には、小胞体とミトコンドリアの接触部位(mitochondria-endoplasmic reticulum(ER)contact site. MERCS)を介した小胞体からのリン脂質およびCa2+の供給が重要でアる。ミトコンドリア外膜に局在するRMDN3(別名PTPIP51)は小胞体膜上のVAPBと結合することでミトコンドリア小胞体間を繋留し、MERCS形成に寄与することが知られている。最近、RMDN3のC末端のtetratricopeptide repeatドメインがホスフアチジン酸(PA)と結合し、PA転移活性をもつことが報告された。PAはミトコンドリア内クリステ構造の形成に重要なカルジオリピン(CL)の合成に不可欠なリン脂質でアる。MITOLはミトコンドリア外膜に局在するE3ユビキチンリガーゼでアり、Mitofusin-2のオリゴマー化を促進することでMERCS形成を促進することが報告されている。MITOLの喪失はMERCS量を減少させ、Ca2+の輸送不全を招き、さらにはCL量の減少とクリステ構造の崩壊を引き起こす。そのほか、MERCSにおいてMITOLは小胞体ストレスセンサーの抑制や抗ウイルス免疫応答の制御にも寄与している。

 本研究ではMERCSにおけるユビキチンシグナルの生理的役割を探索するため、MITOLの近傍夕ンパク質のスクリーニングを行なった。その結果、MERCS関連タンパク質が複数同定され、特にRMDN3はMITOLの新規結合候補として高いスコアを示した。よって、RMDN3に着目し、MITOLとの相互作用について解析した。

【結果】
1. MITOLの新規結合候補としてMERCS関連タンパク質が複数同定された
 近位依存性ビオチン標識の一種でアるAPEX2法を用いて、MITOLの近傍に存在するタンパク質の網羅的スクリーニングを試みた。APEX2をN末端に融合したMITOLを安定発現させたHEK293細胞を樹立し、その細胞においてビオチン標識を行った。非特異的に標識されたサイトゾルタンパク質を解析から除くため、ジギトニンを用いて膜タンパク質のみを抽出した。スクリーニングの結果、MERCS関連タンパク質のほか、ミトコンドリア以外のオルガネラに局在するタンパク質も多数同定された。STRINGデータベース解析により、MITOLとRMDN3との相互作用の存在が示唆された。

2. RMDN3はMITOLの新規基質である
 免疫沈降法により、実際にRMDN3とMITOLは結合し、MITOLのニビキチンリガーゼ活性依存的にRMDN3はニビキチン化されることが明らかとなった。

3. MITOLはリジン63結合性ポリニビキチン鎖をRMDN3の89番目のリジンに転移させる
 特定のニビキチン鎖を形成できないニビキチン変異体を用いた検討や脱ニビキチン化アッセイより、MITOLはRMDN3にリジン63結合性のニビキチン鎖を付加することが示唆された。RMDN3の89番目のリジン(K)をアルギニン(R)に変異させるとMITOLによるニビキチン化が一部消失した。これらの結果から、MITOLはRMDN3の89番目のリジンにニビキチン鎖を付加することで活性を制御することが示唆された。

4. MITOLによるニビキチン化はVAPBとの結合ではなく、RMDN3のホスフアチジン酸結合活性を促進する
 過剰発現、内在性のいずれにおいてもRMDN3とVAPBの結合にMITOLの有無は影響しなかった。野生型のRMDN3に比べ、K89R変異体はPAをコートしたビーズへの結合量が減少した。また、内在性のRMDN3についてもMITOLの欠損によりPAへの結合が減少することが明らかとなった。

【結論】
 MITOLによるユビキチン化はRMDN3のPA結合活性を上昇させることが示唆された。よって、MITOLはRMDN3の活性化を促進してミトコンドリアへのPA輸送量を上昇させている可能性がアる。今回の発見は、MERCSおけるリン脂質輸送がユビキチンシグナルによって制御されることを示唆している。

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