微生物由来酵素を用いたアミノ酸誘導体の製法に関する研究
概要
微生物由来酵素を用いた
アミノ酸誘導体の製法に関する研究
2023 年 1 月
高倉 康彰
微生物由来酵素を用いた
アミノ酸誘導体の製法に関する研究
筑波大学大学院
理工情報生命学術院
生命地球科学研究群
生命農学学位プログラム
博士(生命農学)学位論文
高倉 康彰
目次
第一章
序論 .............................................................................. 3
第一節
アミノ酸とアミノ酸誘導体 .................................................................. 3
第二節
香粧品原料としてのアシルアミノ酸 ....................................................... 3
第三節
フレーバー素材としてのベンズアルデヒド .................................................. 4
第四節
微生物由来酵素を用いる製法 ........................................................... 5
第五節
本研究の目的と本論文の構成 ........................................................... 6
第二章
N-ラウロイル-L-フェニルアラニン(Lau-Phe)分解菌の単離と同定 .... 7
第一節
緒言 ......................................................................................... 7
第二節
材料および方法 ............................................................................ 7
第三節
集積培養による N-ラウロイル-L-フェニルアラニン(Lau-Phe)分解菌の単離 .. 12
第四節
LP5_18B 株の同定.................................................................... 15
第五節
まとめと考察 .............................................................................. 17
第三章
アシルアミノ酸合成酵素の精製と酵素学的解析、および遺伝子の同定 . 19
第一節
緒言 ....................................................................................... 19
第二節
材料および方法 .......................................................................... 19
第三節
目的酵素の精製 ......................................................................... 24
第四節
酵素学的諸性質の解析 ................................................................. 27
第五節
精製酵素を用いた各種アシルアミノ酸の合成 ......................................... 31
第六節
アシルアミノ酸合成酵素遺伝子の同定................................................. 37
第七節
まとめと考察 .............................................................................. 39
第四章
ベンズアルデヒドの酵素合成ルート構築 ..................................... 41
第一節
緒言 ....................................................................................... 41
第二節
材料および方法 .......................................................................... 43
第三節
酵素4種を用いる基本ルートの構築 ................................................... 49
第四節
HMAS のスクリーニング ................................................................. 51
第五節
まとめと考察 .............................................................................. 53
第五章
酵素改変によるベンズアルデヒド収率の向上 ............................... 54
第一節
緒言 ....................................................................................... 54
第二節
材料および方法 .......................................................................... 54
第三節
酵素の性質解析と改変.................................................................. 60
第四節
改変型酵素を用いたベンズアルデヒドの生成 .......................................... 64
第五節
まとめと考察 .............................................................................. 66
第六章
引用文献
総括 ............................................................................ 68
...............................................................................70
1
謝辞
...................................................................................77
2
第一章 序論
第一節 アミノ酸とアミノ酸誘導体
アミノ酸はタンパク質の構成要素であり、栄養素としての研究が 1900 年代から進められてきた
(Willcock EG 1906, Osborne TB et al. 1914)。また、グルタミン酸塩がうま味を呈することが
見いだされ、1909 年から調味料として販売が開始された(池田 1908, Sano C 2009)。その後も
様々な機能や用途が研究され、現在では食品・飲料だけではなく、医薬品、再生医療用培地、化粧
品、飼料、肥料などにも活用されている(中森 2008)。2021 年のアミノ酸生産量は 1000 万トン
に達し、2027 年には 1300 万トンを超えると試算されている(IMARC Group 2022)。
アミノ酸誘導体は、アミノ酸の分子構造を一部変化させた化合物であり、主にアミノ酸を原料として生
産される。自然界から単離されたアミノ酸誘導体の例としては、高峰によるアドレナリン(Takamine
1902)、Raab らによるドーパミン(Raab W et al. 1951)、Rapport らによるセロトニン
(Rapport MM et al. 1948)などがあり、アミノ酸と同様に古くから機能や活用に関する研究が進め
られてきた。アミノ酸誘導体は、アミノ酸類を分析するためにも用いられてきた。ニンヒドリンによるアミノ酸の
比色定量法も、アミノ酸誘導体を活用した例と言える(Moore S et al. 1948, 1958)。現在では
様々なアミノ酸の誘導体化試薬が開発され、高感度での高速分析やキラル分析も可能になっている
(Shimbo K et al. 2009, Gogami Y et al. 2011, Harada M et al. 2019)。ペプチドを合
成する際には、保護基が導入されたアミノ酸誘導体が用いられてきた。特に、ベンジルオキシカルボニル
(Cbz)基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基、tert-ブトキシカルボニル(t-Boc)
基が導入されたアミノ酸は、現在でも様々なペプチドの合成に活用されている(Bergmann M et al.
1932, Carpino AL et al. 1972, Lundt BF et al. 1978)。ペプチドもまたアミノ酸誘導体であ
り、L-フェニルアラニンメチルエステルと L-アスパラギン酸の縮合物である甘味料アスパルテームも、アミノ酸
誘導体と言える(Ariyoshi Y 1976, Leuchtenberger W et al. 2005)。グルタミンは水溶液中
での安定性が低く容易にピログルタミン酸へと変換されてしまうため、アラニンを付与したジペプチドである
L-アラニル-L-グルタミンが培地や飼料の添加剤として用いられることもある(Imamoto Y et al.
2013, Lima NL et al. 2007, Zou TD et al. 2019)。神経伝達物質としてよく知られている
GABA(gamma-aminobutylic acid)も、グルタミン酸の脱炭酸により得られるアミノ酸誘導体であ
り、現在ではサプリメントや食品成分として広く用いられている(Pascual-Anaya J et al. 2006,
Boonstra E et al. 2015)。
このように、安価なアミノ酸から様々な機能や呈味を有する誘導体が得られるため、幅広い用途での
活用が期待されている(Zhao CJ et al. 2016)。
第二節 香粧品原料としてのアシルアミノ酸
3
化粧品と薬用化粧品を合わせて香粧品と呼ばれ、ファンデーションや口紅の他、石鹸やシャンプーなどス
キンケア製品全般が含まれる(徳永 2021)。洗浄系製品には界面活性剤が用いられ、肌に触れる
こと、日常的に使用することから、洗浄力の他にも人体への安全性や低刺激性が求められる(押村
2013)。また近年では、製造や使用に際して発生する環境への影響を低減させることも重視される
(LOREAL 2020, Unilever 2021)。
アシルアミノ酸は、アミノ酸と脂肪酸から生成されるアミノ酸誘導体であり、界面活性作用に関する報
告は 1930 年代の Hentrich らによる、アシルサルコシン塩などの洗浄剤、シャンプー、歯磨きなどへの応
用に関する特許に始まったとされる(坂本 1995)。代表的なアシルアミノ酸としては、ラウリン酸と L-グ
ルタミン酸から生産される N-ラウロイル-L-グルタミン酸塩などが挙げられる。安全性や生分解性の高さが
確認され、現在では洗浄剤として広く用いられている(Takehara M et al. 1972, 吉田ら
1975)。また、グルタミン酸以外のアミノ酸を用いるアシルアミノ酸についても、性質解析や利用検討が
広く進められてきた(Mhaskar SY et al. 1990, Pinazo A et al. 2011, Bordes R et al.
2015, Foley P et al. 2012)。アシルアミノ酸の、香粧品原料以外での利用法や機能としては、酵
素を用いる光学分割による光学活性アミノ酸製法の原料や、タンパク質の安定化剤やリフォールディング
剤、抗炎症作用なども知られている(Tosa T et al. 1966, Imabayashi Y et al. 2016, Wang
W et al. 2013, Abe R et al. 2010, Kudou M et al. 2011, Succar R et al. 2007)。
アシルアミノ酸の工業製法としては、脂肪酸クロリドとアミノ酸を原料として用い、アルカリ条件で縮合さ
せるショッテン・バウマン反応がよく利用される(Takehara M et al. 1972)。バイオ製法についてもいく
つか報告はあるが、おそらく収率の低さや精製工程の煩雑さなどが原因で、工業化には至っていない
(Yokoigawa K et al. 1994, Wada E et al. 2002, Koreishi M et al. 2005, Koreishi M
et al. 2006)。アシルアミノ酸の効率的なバイオ製法としては、Nε-ラウロイル-L-リジンの酵素製法が
知られている。Nε-ラウロイル-L-リジンは撥水性を有する機能性粉体であり、Streptomyces
mobaraensis 由来 Nε-リジンアシラーゼを用いることで、ラウリン酸と L-リジンから 90%以上の高収率
で得ることが報告されている(Koreishi M et al. 2005, Koreishi M et al. 2009)。生成物の
Nε-ラウロイル-L-リジンが水に不溶であり、反応液中で析出し系外除去されるために脱水縮合が効率
的に進むのだが、酵素の基質特異性が厳密なため Nε-アシル-L-リジン以外の製法には適用できない。
アシラーゼを用いるアシルアミノ酸の分解については多数の報告があるが、それらの合成活性については調
べられていない(Koreishi M et al. 2009, Arima J et al. 2013, Liu J et al. 2012, Parker
BM et al. 2011)。
今後も、アシルアミノ酸は洗浄剤や化粧品原料として世界的に広く使用されることが見込まれる。ま
た、現行製法よりも環境負荷の小さい製法が求められると予想され、原料の脂肪酸やアミノ酸を修飾す
ることなく、水系で効率的にアシルアミノ酸を生成することができる酵素製法の開発が必要と考えられてい
る。
第三節 フレーバー素材としてのベンズアルデヒド
4
フレーバーとは、食品に香気を付与または増強するために用いられる香料であり、香粧品の香料として
用いられるフレグランスとは区別される。香料を大別すると、天然香料と合成香料に分類される(堀内
2005)。近年の自然派嗜好やサステイナブル素材への関心により、ナチュラルフレーバーと呼ばれる天
然香料やバイオ製法品への需要が世界的に高まっている(Goodman MJ 2017)。フレーバー成分
のバイオ製法としては、世界的に最もよく使用される香料であるバニリンに関する報告が多く、関心も高い
(Banerjee G et al. 2019, Ciriminna R et al. 2019, Martău GA et al. 2021)。Solvay
社の RhovanilⓇ、BASF 社の Natural Vanillin F など、バニリンのバイオ製法品はすでに生産、販売
されている(Leffingwell JC et al. 2015)。
ベンズアルデヒドはアーモンドの香りを呈する化合物で、ビターアーモンドやアンズの芯から抽出される精
油の主成分である。フレーバーとして飲料や食品に用いられるだけでなく、フレグランスとして香水等にも広
く用いられており、バニリンに次いで生産量の多い香料としても知られている(Surburg H et al.
2006, Gupta VK 2016)。また、合成化学ではビルディングブロックとして用いられ、プラスチック用添
加剤としても利用されている(Baumann M et al. 2013, Patel RN 2016)。抗菌作用や抗酸化
作用を示すという報告もある(Ullah I et al. 2015)。生産方法は化学合成が主流で、トルエンの
酸化により生成される。カッシア油から得られるシンナムアルデヒドを基質とし、レトロアルドール反応により
ベンズアルデヒドを生成させる手法もよく用いられる。また、ビターアーモンドや杏仁からの抽出によっても得
られる(Clark GS 1995)。
ベンズアルデヒドのバイオ製法としては、L-フェニルアラニンを原料に用いて検討されてきたが、収率は低
く、また蓄積は低濃度に留まっており、効率的な製法は未だ構築されていない(Jensen KA et al.
1994, Kawabe T et al. 1994, Krings U et al. 1996, Nierop Groot MN et al. 1998,
1999, Lomascolo A et al. 2001)。これらの製法では効率的なベンズアルデヒド生成に至らない
理由として、生成に関与する酵素活性の低さ、副反応の多さ、反応経路の複雑さ、などが考えられる。
バニリンと比較しベンズアルデヒドは、植物からの抽出でも比較的安価に得られることや、市場規模が小
さいことから、バイオ製法の開発が進められてこなかった可能性がある。ただし、今後は特定の植物原料に
頼らず、環境負荷が小さく持続可能なバイオ製法が求められると考えられる。
第四節 微生物由来酵素を用いる製法
アミノ酸の生産に用いられるバイオ製法としては、糖などの炭素源を基質に用いて生育とともに目的物
質を生成させる発酵法の他に、目的物質の前駆体を基質に用いて酵素または酵素発現菌によって変
換させる酵素法がある(横関 1999)。アミノ酸誘導体についても、アミノ酸と同様に発酵法と酵素法
の適用が可能だが、原料のアミノ酸(または類似物質)が比較的安価に入手可能で、アミノ酸誘導体
が菌体の生育に影響を及ぼすと懸念される場合には、酵素法が適していると考えられる。
アミノ酸またはアミノ酸誘導体の工業生産に酵素法が適用された例としては、L-テアニン
(Pseudomonas nitroreducens 由来グルタミナーゼを使用)、アスパルテーム
(Sphingobacterium sp.由来アミノ酸エステルアシルトランスフェラーゼを使用)、D-p-ヒドロキシフェ
5
ニルグリシン(Pseudomonas putida 由来ヒダントイナーゼおよび Agrobacterium sp.由来 D-カル
バミラーゼを使用)、L-ドーパ(Erwinia herbicola 由来チロシンフェノールリアーゼを使用)、L-アスパ
ラギン酸(E. coli 由来アスパラギナーゼを使用)、L-アラニン(Pseudomonas dachunhae 由来
L-アスパラギン酸デカルボキシラーゼを使用)、などが挙げられる(太陽化学株式会社 2009、味の素
株式会社 2017、中森 2009)。いずれも微生物由来酵素が使用されており、基質特異性や安定
性など目的の性質に合致する酵素の探索源として、微生物が適していたと推察される。
近年では、データベース上のゲノム情報から探索を開始する、ゲノムマイニングと呼ばれる手法を用いた
新規化合物や新規酵素遺伝子の発見についても報告されている(Matsuda K et al. 2022,
Choirunnisa AR et al. 2022)。シークエンス技術の発展に伴い急速に微生物ゲノムの情報が拡充
され、これまで知ることのできなかった多様な代謝経路および酵素を利用しやすくなったと考えられる。
第五節 本研究の目的と本論文の構成
安価なアミノ酸から生成が可能で、かつ様々な機能を有するアミノ酸誘導体は産業的に重要な化合
物群である。界面活性剤として作用するアシルアミノ酸は香粧品原料として、特有の香気を有するベンズ
アルデヒドはフレーバー素材として、いずれも世界的に活用されている重要な成分で今後も需要は拡大す
ると考えられている。そのため、現在用いられている化学合成法や抽出法に代わる、環境負荷の低いバイ
オ製法で生産することが将来は必要になると考えられるが、これまでに効率的なバイオ製法は構築されて
いなかった。
そこで、本研究の目的として、アシルアミノ酸およびベンズアルデヒドの効率的な酵素製法を構築すべ
く、目的に合致する酵素の取得と、得られた酵素を用いた製法の開発を進めることとした。酵素の探索源
としては、酵素製法の実績が多く、取り扱いが比較的容易と推察される微生物を用いることとした。開発
される酵素製法は、溶媒や危険な薬剤を用いないため環境負荷が小さく、かつ特定の原料に頼らないた
め安定で持続的な製法になると期待された。
本論文の構成は以下のとおりである。まず第二章では、N-ラウロイル-L-フェニルアラニン(以下、LauPhe)分解菌の単離と同定について述べる。第三章では、Lau-Phe 分解菌から精製したアシルアミノ
酸合成酵素の諸性質および同定した遺伝子について述べる。第四章では、ベンズアルデヒドの酵素合成
ルートに用いる酵素4種の評価と、マンデル酸合成酵素のスクリーニングについて述べる。第五章では、マ
ンデル酸合成酵素の改変による機能改善と改変型酵素の性質解析、および改変型酵素を用いるベン
ズアルデヒドの生成について述べる。最後に第六章で、本研究全体の総括と、今後の展望について述べ
る。
6
第二章 N-ラウロイル-L-フェニルアラニン(Lau-Phe)分解菌の単離と同定
第一節 緒言
アシルアミノ酸の合成活性を有する酵素としては、アミノアシラーゼ(Yokoigawa K et al. 1994,
Wada E et al. 2002, Koreishi M et al. 2005)、ε-リジンアシラーゼ(Koreishi M et al.
2006, 2009)、リパーゼ(Soo EL et al. 2003)、カプサイシン分解酵素(Koreishi M et al.
2006)、などが報告されている。これらはアシルアミノ酸の生成に用いることが可能だが、様々なアシルア
ミノ酸を効率的に生成することはできなかった。
そこで、脂肪酸とアミノ酸から様々なアシルアミノ酸を生成させられる酵素を探索し、新たな酵素製法
の確立を試みることとした。アシルアミノ酸を分解する酵素ならば、逆反応によるアシルアミノ酸の合成も可
能と考え、アシルアミノ酸の分解酵素(菌株)を取得することとした。酵素源を広く自然界から探索する
ため、集積培養を用いたアシルアミノ酸分解菌の取得を試みた。香粧品に用いられるアシルアミノ酸に
は、ラウリン酸がアシル基の供与体として用いられることが多く、またフェニルアラニンは HPLC での分析が
容易なことから、基質には N-ラウロイル-L-フェニルアラニン(以下、Lau-Phe)を使用した。 ...