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Enoxaparin promotes functional recovery after spinal cord injury by antagonizing PTPRσ

伊藤, 定之 名古屋大学

2022.01.27

概要

【緒言】
　中枢神経系(CNS)では、軸索が損傷されると外因性阻害因子と内因性軸索再成能が低いために、軸索の再生とそれに続く機能回復は制限される。コンドロイチン硫酸(CS)は、主要な外因性の成長阻害因子である。CSは、神経細胞の受容体であるProtein Tyrosine Phosphatase Receptorσ(PTPRσ)に結合し、軸索伸長を阻害するシグナルを誘導する。一方でヘパラン硫酸(HS)は、PTPRσと相互作用するが、軸索の成長を促進する。この軸索再生におけるPTPRσの作用は、PTPRσの分子スイッチモデルによって説明される。我々の研究で、PTPRσの細胞内プロテインチロシンホスファターゼ活性は、細胞外ドメインの状態で制御されて、HSは、PTPRσの多量体化を起こし不活性化する一方で、CSは、PTPRσの単量体化を起こすことで活性化することを示した。加えて、HSとCSの4糖は、PTPRσと1:1の比率で相互作用することができる最小の構造であることを示し、少なくとも2分子の受容体と結合するのに十分な長さのHSとCSは8糖以上で、HSが8糖以上でその効果を発揮することを示している。
　肺血栓塞栓症や深部静脈血栓症の予防および治療のために使用されている薬剤であるエノキサパリンは、平均分子量45kDaで、8糖以上のHSであり、PTPRσの作用を不活化させる可能性がある。本研究の目的は、エノキサパリンが、PTPRσに拮抗し、生体内の軸索損傷後に治療効果を発揮するかどうかを明らかにすることである。

【対象及び方法】
　市販の低分子量ヘパリン(LMWH)であるエノキサパリンを用いて、PTPRσとの相互作用、生体内の軸索損傷に対する効果を検討した。ネガティブコントロールとして、ヘパリン5糖からなる分子量17kDaのフォンダパリヌクスを用いた。
　エノキサパリンとPTPRσとCSの相互作用を検討するため、表面プラズモン共鳴(SPR)実験と等温滴定型カロリメトリー(ITC)を行った。SPR実験は，BIAcoreX100装置(GEヘルスケア)を用い、ビオチン化したCS-E4糖(bE4)をストレプトアビジンセンサーチップに固定化して行った。iTCは、iTC200システム(Malvern社)を用いて、ヒトPTPRσIg12ドメイン(0.08mM)を、1mMの滴定液に対して2μLずつ25℃で滴定し行った。
　PTPRσの活性を検討するため、HEK293Tでv-srcを過剰発現させ、PTPRσを共発現させ、エノキサパリンとフォンダパリヌクスで処理を行い、一連のリン酸化をウェスタンブロッティングで評価した。
　PTPRσの細胞外ドメインと上皮成長因子受容体(EGFR)の細胞内ドメインからなるPTPRσTKを作成し、EGFRのリン酸化でPTPRσの多量体化を評価可能とし、PTPRσの細胞表面の多量体化を確認した。
　8週齢のSprague-Dawley種雌ラットを使用し、視神経を鑷子で圧挫した視神経損傷(ONC)モデルで、エノキサパリンの軸索再生効果を検討した。視神経のanterograde tracer(CTB594)を眼球内に注射し、再生した線維を可視化した。生理食塩水またはエノキサパリン(50μg/日)を損傷24時間後から投与開始し、毎日皮下注射し、14日後、視神経の縦断面を観察した。
　8週齢のSprague-Dawley種雌ラットを使用し、第9胸椎椎弓切除を行い、脊髄損傷装置(Infinite Horizon Impactor, Precision Systems and Instrumentation)を用いて200kdynの胸髄圧挫損傷モデルを作成し、エノキサパリンが脊髄損傷後の機能を検討した。ラットを3群に分け、脊髄損傷後24時間後からエノキサパリン(50μg/日)、フォンダパリヌクス(175μg/日)、生理食塩水を毎日皮下注射した。運動機能はBasso, Beattie and Bresnahan(BBB)スコアとFoot Fault stest、感覚障害はTouch testで評価した。
　脊髄損傷後84日目にエノキサパリンと生理食塩水を投与したラットの脊髄の組織学的解析を行った。脊髄の冠状切片において、病変部位から頭側3mm、尾側3mmの位置で、GAP43とSERT、損傷高位のCS56を検討した。また、出血リスク評価のため、脊髄損傷1週間後の脊髄切片をベルリンブルー染色で評価した。

【結果】
　SPRでbE4に結合したPTPRσは、vehicle(HBS-EP)、フォンダパリヌクス、エノキサパリンの注入後、vehicleでは影響を受けず、フォンダパリヌクスではわずかに、エノキサパリンでは急速に溶出した(Fig.1A)。これは、エノキサパリンが、CSをPTPRσから分離することを示している。等温熱量測定(iTC)では、エノキサパリンとPTPRσの反応では、約1:6.5の結合を示し、フォンダパリヌクスは明らかな相互作用を示さなかった(Fig.1C)。これはエノキサパリンはPTPRσと強く相互作用し、多量体化させると考えられる。
　HEK293Tでv-srcを過剰発現させ、リン酸化を誘導した後、PTPRσを共発現させるとリン酸化が低下し、エノキサパリンで処理すると、PTPRσによる脱リン酸化がキャンセルされたが、フォンダパリヌクスで処理してもほとんど影響はなく(Fig.2A)、エノキサパリンがPTPRσに特異的に拮抗することを示唆している(Fig.2B)。
　エノキサパリンはPTPRσTKのリン酸化を誘導し、細胞表面のPTPRσの多量体化を誘導した(Fig.2C,D)。ONCモデルの視神経の縦断面を観察したところ、傷害部位を挟んで0.25mmの位置にある再生軸索の数は、エノキサパリンを投与したラットの方が生理食塩水を注入したラットよりも有意に多かった(Fig.3A,B)。
　脊髄損傷モデルにおける検討で、エノキサパリン投与群が生理食塩水投与群に比べて、BBBスコアは有意に高く(Fig.4A,B)、Foot Faults testは有意に少なく(Fig.4C)、Touch testは有意に高かった(Fig.4D)。これはエノキサパリン投与で運動と感覚の機能回復が良好であったことを示している。
　GAP43、SERT陽性線維の割合はエノキサパリン投与群で、生理食塩水投与群と比較して、頭側と尾側の両方で有意に高かった(Fig.5C,D,E,F)。また、エノキサパリン投与群しと生理食塩水投与群で、CSの蓄積量、ベルリンブルーの面積に有意差はなかった(Fig.5G,H,I,J)。これは、エノキサパリンがCSの蓄積を変化させることなく、組織学的回復を促進することと血腫のリスクを増加させないことを示唆している。

【考察】
　これまでに、軸索損傷に対してCS-PTPRσの経路を標的とした治療の有効性が報告されており、その経路を阻害する主な2つの報告があり、コンドロイチナーゼABCによるCSの分解と、PTPRσの細胞内ドメインのウェッジ配列による活性を抑制である。しかしながら、PTPRσの細胞外ドメインを用いた受容体の調節による治療の報告はない。我々はこれまでに、8糖のHSがDystrophic endballの形成を阻害し、軸索再生を促進することを報告している。本研究では、この原理をinvivoの脊髄損傷モデルに適用するため、PTPRσを多量体化させるのに十分な長さを持つエノキサパリンに着目し、検討を行った。エノキサパリンはin vitroでPTPRσと強く相互作用し、培養細胞ではPTPRσを介した細胞内シグナル伝達を抑制した。逆に、HSの5糖であるフォンダパリヌクスは、PTPRσと非常に弱い相互作用しか示さず、これは、4糖がPTPRσと結合できるHSの最小長であるという我々の以前の結果と一致していた。
　急性期の脊髄損傷にエノキサパリンを投与する場合、異常出血の問題がある。脊髄損傷患者の深部静脈血栓症の予防にエノキサパリンの投与が行われており、有害事象の増加なく、術後24～72時間に開始して最大で2週間の投与が可能とされている。今回のSCIラットモデルでは、エノキサパリンを3週間投与することで機能回復が促進され、投与期間中に異常出血が観察されなかったが、脊髄損傷患者へのエノキサパリンの長期使用には十分な注意が必要である。

【結語】
　エノキサパリンは、in vitroでPTPRσとCSPGの結合を阻害し、自らがPTPRσと結合し、PTPRσを多量体化させることでその活性を阻害した。加えて、ラット脊髄損傷モデルに対し、エノキサパリンの投与は機能回復を促進した。これらから、エノキサパリンは脊髄損傷の治療に有望な化合物である。

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