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Zonisamide ameliorates neuropathic pain partly by suppressing microglial activation in the spinal cord in a mouse model

小清水, 宏行 名古屋大学

2021.04.23

概要

【緒言】
　神経障害性疼痛の原因としては主に外傷、糖尿病、脊柱管狭窄、感染症等による神経損傷が原因であることが多い。現在神経障害性疼痛にはプレガバリンや非ステロイド性抗炎症薬が処方されているが、通常ほとんどの症例で効果は限定的であり、時には副作用を伴うこともある。神経障害性疼痛の根底にある細胞メカニズムはまだほとんど解明されていないが、近年中枢神経系(CNS)の免疫担当細胞であるミクログリアが神経障害性疼痛の誘発に重要な役割を果たしていることが明らかになっていた。
　抗てんかん薬であるZonisamide(ZNS)はパーキンソン病(PD)マウスモデルの脳内において、ミクログリアを介する神経炎症を抑制する効果が報告されている。また神経障害性疼痛に対しても効果があるとの報告が散見されるが、作用機序はいまだ不明であった。本研究ではL4神経根を切断した神経障害性疼痛マウスモデルを用いて、ZNSの神経障害性疼痛に対する効果と脊髄におけるミクログリアへの影響を調べた。また培養ミクログリアと培養感覚神経を用いてZNSの効果を評価した。

【対象及び方法】
　12-14週の雄C57BL/6マウスのL4神経根を切断し、神経障害性疼痛の1つであるアロディニアを誘発させた。5週間毎日ZNSを30mg/kg/dayを経口投与し、疼痛評価として週1回von Frey test、Cat walk testを行った。投与後4週目に組織学的評価としてミクログリアの数と面積を計測するため、L4脊髄後角を採取し抗Iba1抗体を使用して免疫染色も行った。加えて神経障害性疼痛の発生に関連する遺伝子発現を検出するため、先と同様にL4脊髄後角を採取しqRT-PCRを行った。全ての実験においてL4神経根切断後溶媒のみを経口投与したControl群と比較した。またZNSのミクログリアに及ぼす影響を検討するためマウス由来のBV2細胞株をLPS刺激で活性化させ、さらに異なる濃度のZNSを添加して24時間後に遺伝子発現量を定量的qRT-PCRで検討した。ZNSの感覚神経に対する効果を評価するためにラットDorsal root ganglion由来細胞株50B11に異なる濃度のZNSを添加して48時間後に抗PGP9.5抗体を用いて免疫染色を行い、軸索伸張についてArray Scanを用いて測定した。

【結果】
　作製したアロディニアマウスモデルにZNS経口投与を行うと5週間目で、von Frey testにおいて疼痛の改善が認められた(図1A)。また4週間目で、Cat walk testにおいてMax contact max intensity(最大接地における最大輝度)とDuty cycle(歩行周期中の立脚期の割合)の値が上昇し疼痛の改善による歩行運動の改善が考えられた(図1CD)。また抗Iba1抗体を使用した免疫染色では4週間ZNS投与により脊髄後角におけるミクログリアの数と面積が減少傾向であった(図2A-C)。加えて、PD患者の死後脳における活性化ミクログリアで発現が増加していると言われているニコチンアミド-アデニンジヌクレオチドリン酸還元型(NADPH)オキシダーゼの触媒サブユニットであるcybb、活性化したM1ミクログリアのマーカーであるCd68、ミクログリア活性化に関わるIrf5やIrf8、および炎症反応関連遺伝子であるIl1bが、4週間ZNS投与マウスの脊髄後角組織において有意に抑制されることがqRT-PCRによって明らかとなった(図3)。これらの結果から、アロディニアマウスモデルの脊髄後角においてZNS投与はミクログリア活性化マーカーや炎症性サイトカインの発現を抑制していることが示唆された。MTSアッセイを用いて50ng/mlのLPS刺激下でZNSを0-10µMの範囲で添加しても細胞生存率に変化がないことを確認した(図4A)。一方ZNS添加によりLPS刺激によりアメーバ状の形態となったBV2細胞株の数は有意に減少していた(図4BC)。また、BV2細胞株においてLPS刺激で上昇したCybb、炎症反応関連遺伝子であるTnf、マウス特異的ミクログリアマーカーであるAdgre1の遺伝子発現はZNS添加で有意に減少していた(補足図S1B-D)。
　50B11細胞株に対してZNSが0-20µMの範囲内で有害性はないことを確認した(図5A)。50B11細胞株の軸索のAverage neurite length 及びAverage number of branch points per neuronはZNS添加により有意に上昇した(図5BC)。

【考察】
　我々はまず、抗てんかん薬・抗PD薬であるZNSが、L4脊髄神経の切断で誘発した神経障害性疼痛のマウスモデルにおいて、抗アロディニア効果を発揮することを発見した(図1A-D)。脊髄神経損傷は脊髄後角のミクログリアを活性化する、またこのミクログリアの活性化は神経障害性疼痛と因果関係があると考えられている。本研究では、事実このアロディニアマウスモデルにおいて、ミクログリアの細胞形態の変化と増殖、免疫表面抗原の増加と炎症性サイトカインの産生増加が見られている（図2A-C）。このとき、ZNS投与により神経損傷測のL4脊髄後角におけるIba1陽性ミクログリアの増加が抑制され（図2A-C）、また、ZNS添加によりLPSによるアメーバ状の培養BV2ミクログリアの数が減少していた（図4BC）。加えてZNS処理は、マウスモデル（図3）の脊髄後角の損傷部および培養BV2ミクログリアの双方において、Cybb、TnfおよびAdgre1の遺伝子発現を抑制した（補足図S1B-D）。他の論文で、同様の遺伝子発現抑制作用は、PDマウスモデルの基底核において報告されている。またZNSが急性の熱性および機械的侵害刺激に対しての鎮痛効果も示されている。以上のことから、ZNSがナトリウムチャネルおよびT型カルシウムチャネルを阻害することで抗アロディニア効果を示す可能性も残っているが、一方でZNSは少なくとも一部、後角のミクログリアを介した一連の神経炎症性シグナル伝達イベントを抑制することで、抗神経障害効果を発揮していると考えられた。
　我々は以前ZNSが一次脊髄運動神経（SMN）の軸索伸長を誘導することを報告したが、本研究では、ZNSが50B11細胞株の分岐点数をわずかに増加させ、神経突起の伸長を促進することを示した（図5BC）。我々の結果と同様にZNSは後根神経節由来の一次感覚神経の軸索伸長を促進するという報告がある。一方、損傷を受けた一次求心性感覚神経の異常発芽が末梢神経障害性疼痛の病態を促進しているという報告もされており、神経障害性疼痛においてZNSの感覚神経に対する軸索伸長効果がミクログリアに対する効果を弱めている可能性も否定できない。将来的にZNSを臨床的に利用できるようにするため、例えば動物モデルを用いて抗アロディニア効果を指標に投与量や投与プロトコルを最適化する追加試験が必要であると考える。

【結語】
　ZNSはアロディニアを起こしたマウスにおいて脊髄後角におけるミクログリアの数を減らし、抗炎症作用を示し神経障害性疼痛を改善させた。またBV2細胞株においても抗炎症作用を示し、50B11細胞株の軸索伸長を促した。これらの結果からZNSは神経障害性疼痛に対する治療薬となる可能性が示唆された。

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