論文の公開元へタンパク質凝集体ALISを介した新規パータナトス誘導機構の解明
概要
博士論文
タンパク質凝集体 ALIS を介した
新規パータナトス誘導機構の解明
令和 4 年度
東北大学大学院薬学研究科
生命薬科学専攻
鈴木 碧
目次
略語
p. 2
緒論
p. 5
結果
1.
CTX は非炎症性の細胞死を誘導する
p. 9
2.
CTX はヒドロキシラジカル依存的に細胞死を誘導する
p. 13
3.
CTX はヒドロキシラジカル依存的に DNA 損傷を誘導する
p. 16
4.
CTX は PARP-1 の活性化を誘導する
p. 20
5.
酸化ストレス依存的にミトコンドリアが集積する
p. 24
6.
ALIS 依存的にミトコンドリアが集積する
p. 29
7.
PARP-1 依存的にミトコンドリアが集積する
p. 32
8.
微小管輸送依存的にミトコンドリアが集積する
p. 35
9.
CTX は細胞死誘導に先立って分裂初期アレストを誘導する
p. 38
10. ALIS 依存的に分裂初期アレストが誘導される
p. 42
11. 分裂初期アレストした細胞において ROS 依存的な PARP-1 の活性化
p. 45
により細胞死が誘導される
12. 細胞周期が分裂期まで進行することが細胞死誘導に必要である
p. 48
13. ALIS を除去すると分裂が再開される
p. 52
考察
p. 54
結論
p. 60
実験材料および実験方法
p. 61
参考文献
p. 73
発表論文
p. 81
謝辞
p. 82
1
略語
本文中および図表中では、以下の略語を使用した。
4PBA; 4-phenylbutyrate
AIF; Apoptosis-inducing factor
ALIS; Aggresome-like induced structures
ATM; ataxia telangiectasia mutated
BAX; Bcl-2-assosicated X protein
BSA; bovine serum albumin
CDK1; cyclin-dependent kinase 1
CDKs; Cyclin-dependent kinases
COX Ⅳ; cytochrome c oxidase Ⅳ
CRISPR; Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
CTX; cefotaxime
DAPI; 4’,6-diamidino-2-phenylindole
DFO; deferoxamine
DMEM; Dalbecco’s modified Eagle’s medium
DSB; Double strand break
EDTA; ethylenediamine N,N,N’,N’ tetraacetic acid
FBS; fetal bovine serum
FITC; fluorescein isothiocyanate
GPx; glutathione peroxidase
HSP70; heat shock protein 70
JNK; c-Jun N-terminal kinase
KO; knockout
2
LDH; Lactate dehydrogenase
MAP3K; mitogen-activated protein kinase kinase kinase
MAPK; mitogen-activated protein kinase
MDM2; mouse double minute 2 homolog
MIF; Macrophage migration inhibitory factor
MNNG; N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine
MTOC; microtubule (MT)-organizing center
MTS; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium
inner salt
NAC; N-acetylcysteine
NAD+; nicotinamide adenine dinucleotide
NF-κB; nuclear factor-κB
PAR; Poly(ADP-ribose)
PARP-1; Poly(ADP-ribose) polymerase-1
PBS; phosphate buffered saline
PBS; phosphate-buffered saline
PCR; polymerase chain reaction
PI; Propidium iodide
PMS; phenazine methosulfate
PUMA; p53-upregulated modulator of apoptosis
PVDF; polyvinylidene difluoride
ROS; Reactive oxygen species
SDS-PAGE; SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
SDS; sodium dodecylsulfate
SE; standard error
3
SOD1; superoxide dismutase 1
SOD; Superoxide dismutase
SSB; Single strand break
TAK1; Transforming growth factor-β (TGF-β)-activated kinase 1
TBS-T; Tris Buffered Saline with Tween 20
TDP-43; TAR DNA-binding Protein of 43kDa
TEMED; N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine
TOM20; translocase of outer membrane 20
Tris; 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol
UPS; ubiquitin proteasome system
Ub; Ubiquitin
WCL; Whole cell lysates
WHO; World Health Organization
WT; Wild type
gRNA; guide RNA
4
緒論
生体は、紫外線や病原体、化学物質など様々な環境ストレスに常に曝されているが、こ
れらストレスに対して個々の細胞がストレス応答を誘導することで、個体の恒常性が維持
されている。我々は、薬剤もそのような環境ストレスの１つであると考え、抗菌薬に対す
るストレス応答機構について、分子・細胞レベルで詳細な解析を行なってきた。その中で、
セファロスポリン系抗菌薬の１種であるセフォタキシム (cefotaxime, CTX) が、ミトコンド
リアに作用し、活性酸素種 ROS (reactive oxygen species) の産生を惹起することを見出した
1,2
。ROS は生体内で恒常的に産生されており、過剰な ROS の蓄積は酸化ストレスを誘導し、
細胞機能障害を引き起こす 3。そのため、ROS 産生は適切に制御される必要があるが、そ
の機構は未解明な点も多い。また、細胞の酸化ストレス応答として、抗酸化遺伝子の発現
誘導や細胞死の誘導によって恒常性が維持されており、酸化ストレス応答機構の破綻は
様々な疾患の要因となるため、これらの機構を解明することは重要である 4。CTX による
ミ ト コ ン ド リ ア ROS 産 生 に つ い て 詳 細 に 解 析 し た 結 果 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 様 細 胞 株
RAW264.7 において、MAP3K (mitogen-activated protein kinase kinase kinase) ファミリーの 1
つである TAK1 (Transforming growth factor-β (TGF-β)-activated kinase 1) が、CTX によるミト
コンドリア ROS 産生を亢進することが明らかになった 2。また、TAK1 によるミトコンド
リア ROS 産生亢進作用は、既知の TAK1 下流シグナルである JNK (c-Jun N-terminal kinase)
および p38 などの MAPK (mitogen-activated protein kinase) 経路や NF-κB (nuclear factor-κB) 経
路 5 を介さないことが明らかとなり、TAK1 はミトコンドリアに移行し、未知の基質をリン
酸化することでミトコンドリア ROS 産生を亢進する可能性が示唆された。また、CTX によ
る細胞死誘導機構に関する解析の結果、ヒト繊維肉腫由来細胞株 HT1080 細胞において、
CTX がミトコンドリア ROS を産生することで、PARP-1 (poly(ADP-ribose) polymerase-1) 依
存的な細胞死として定義されるパータナトス (Parthanatos) を誘導することを明らかにした 1。
5
パータナトスは、2009 年に V. L. Dawson らによって提唱された比較的新しいプログラム
細胞死であり、核内のストレス応答分子 PARP-1 に依存した細胞死として定義される
6,7
。
PARP-1 は核内に局在し、生理的条件下においては、DNA 損傷を認識して活性化すると、
NAD+ (nicotinamide adenine dinucleotide) を基質として、ポリ ADP リボース (Poly(ADP-ribose)
(PAR)) を産生することで、DNA 損傷部位に DNA 修復因子を集積させ、DNA 修復を誘導す
る 8。一方で、虚血再灌流障害、炎症、心筋梗塞、グルタミン酸の興奮毒性、パーキンソン
病など、DNA に強いストレスを与える病態では、PARP-1 の過剰活性化により細胞死が引
き起こされる。パータナトスという言葉が提唱され、使用されるようになった 2009 年以前
から、PARP-1 の活性化による細胞死は、アポトーシス（カスパーゼ依存的なプログラム細
胞死）とは異なるカスパーゼ非依存的なプログラム細胞死としてその存在が報告され、解
析が進められていた。
1980〜1990 年代には、DNA アルキル化剤 MNNG (N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine) や
過酸化水素 (H2O2) を高濃度で処置することにより、PARP-1 の過剰な活性化が引き起こさ
れ、PARP-1 の基質である NAD+の枯渇と、それに続く ATP の枯渇によるエネルギー枯渇を
伴い、カスパーゼ非依存的なネクローシス（壊死）が誘導される 9、といった報告などから、
PARP-1 過剰活性化によるエネルギー枯渇が細胞死の原因であるとする仮説が提唱された。
しかし、その後の研究から、PAR ポリマーを直接神経細胞に導入することにより細胞死が
誘導されることが示され、PAR ポリマー自体が、PARP-1 活性化の下流で細胞死を誘導す
ること
10
が明らかとなり、PARP-1 の過剰活性化に起因するエネルギー枯渇のみで PARP-1
による細胞死誘導機構を説明できないことが考えられた。また、細胞質に放出された PAR
ポリマーが、ミトコンドリア局在タンパク質 AIF (Apoptosis-inducing factor) に結合し、AIF
の核移行を引き起こすことで細胞死が誘導されることが明らかにされた 11–13。さらに、AIF
と結合して AIF と共に核移行するヌクレアーゼとして、MIF (Macrophage migration inhibitory
factor) が同定され 14、PAR ポリマーによって誘導される AIF 依存的な細胞死は DNA の断片
化を伴うアポトーシス様の細胞死であることが示された。一方で、PARP-1 活性化に伴う
6
ATP 枯渇も、PAR ポリマーによる解糖系の阻害が原因であることが示され
15,16
、ATP 枯渇
が細胞死誘導に寄与する可能性も十分に考えられる。以上のように、PARP-1 は ATP 枯渇
によるネクロティックな（壊死性）細胞死を誘導する場合がある一方で、ヌクレアーゼの
核移行による DNA の断片化を伴うアポトーシス様の細胞死を誘導する局面もあり、PARP1 が誘導する細胞死の全容解明には至っていないのが現状であり、未知の PARP-1 依存的な
細胞死誘導経路が存在する可能性も十分に考えられる。
また、DNA 損傷によって誘導されるプログラム細胞死として、がん抑制遺伝子 p53 によ
るアポトーシス誘導機構の解明が進んでいる 17。定常状態において、p53 はユビキチン化酵
素 MDM2 (mouse double minute 2 homolog) の標的であり、ユビキチン-プロテアソームシス
テムにより分解されることで、発現量が低く保たれている。一方で、DNA 損傷時には、
DNA 損傷を認識して活性化した ATM (ataxia telangiectasia mutated) などのキナーゼによって
p53 はリン酸化され、MDM2 による分解を免れて安定化すると共に活性化し、p21 などの細
胞周期チェックポイント関連遺伝子や、PUMA (p53-upregulated modulator of apoptosis) や
BAX (Bcl-2-assosicated X protein) などのアポトーシス関連遺伝子の発現を誘導する。これに
より、DNA 損傷が軽度の場合には DNA 修復が誘導されるが、重度の DNA 損傷が起きた際
には p53 依存的にアポトーシスが誘導される。すなわち、DNA 損傷は、p53 依存的なアポ
トーシスと PARP-1 依存的なパータナトスという、２つの細胞死を誘導する可能性があり、
細胞は DNA 損傷の程度や種類によってアポトーシスとパータナトスを使い分けていること
が想定されるが、どのように使い分けられているかは不明である。また、アポトーシスは
発生期における器官形成や、がんの抑制に重要である
18–20
ことが明らかとなっており、そ
の生理的意義が明らかにされている一方で、パータナトスの生理的意義は未だによくわか
っていない。
我々が独自に見出したパータナトス誘導剤 CTX は、ユビキチン化タンパク質から成るタ
ンパク質凝集体 ALIS (aggresome-like induced structures) の蓄積により、パータナトスを誘導
する 1。ALIS は、細胞内に形成されるユビキチン化タンパク質から成るタンパク質凝集体
7
の総称であり、酸化ストレスや小胞体ストレス、病原体感染など様々なストレスによって
形成されることが知られている
21,22
。ALIS は異常タンパク質を一時的に隔離しておくコン
パートメントであると考えられているが 23、ALIS の形成はアルツハイマー病などの神経変
性疾患に共通する病理所見であり、ALIS の細胞毒性が神経細胞死の一因であると考えられ
ている
24
。また近年、これら疾患の発症原因として、パータナトスの関与が多数報告され
ており 25、ALIS がパータナトス誘導を介して神経変性疾患を惹起している可能性が示唆さ
れている。これまでの解析から、CTX は酸化ストレスを惹起し、多機能タンパク質 p62
(SQSTM1) を起点とした多様な修飾によって ALIS を形成させ、ALIS 形成依存的にパータ
ナトスを誘導することが明らかになっている。しかしながら、ALIS によるパータナトス誘
導機構の詳細は未解明なままである。また、細胞死の誘導に ALIS のような大きな構造体
を必要とする理由は不明であった。そこで本研究では、ALIS によるパータナトス誘導機構
の全容を明らかにし、パータナトスの生理的・病理的意義への考察を深めることを目的と
して研究を行った。
8
結果
1.
CTX は非炎症性の細胞死を誘導する
はじめに、ヒト繊維肉腫由来細胞株 HT1080 細胞に CTX を処置した際の細胞死を
MTS/PMS assay により評価した。CTX 処置による細胞生存率の低下は、PARP-1 欠損または
PARP 阻害剤 Rucaparib の処置により抑制された (Fig. 1A, B)。このことから、CTX は PARP1 依存的な細胞死であるパータナトスを誘導することがわかった。次に、DNA をアルキル
化することにより PARP-1 を活性化し、パータナトスを誘導することが知られている既存
のパータナトス誘導剤である MNNG を、HT1080 細胞に処置した際の細胞生存率を調べた。
その結果、MNNG 処置による細胞生存率の低下は、PARP-1 欠損または PARP 阻害剤
Rucaparib の処置により抑制された (Fig. 1C, D)。このことから、MNNG は、HT1080 細胞に
おいて PARP-1 依存的な細胞死であるパータナトスを誘導することがわかった。そこで、
MNNG が誘導するパータナトスと CTX が誘導するパータナトスの比較を行った。MNNG
は、PARP-1 の活性化依存的に ATP の枯渇を誘導し、細胞膜破裂によるネクロティックな
細胞死を誘導することが知られている
9,26
。そこで、MNNG および CTX 処置時の細胞内
ATP レベルを測定した。その結果、MNNG 処置後 30 分で 20%程度まで ATP レベルが低下
し、その低下は PARP-1 欠損細胞において抑制されたことから、PARP-1 依存的に急激な
ATP レベルの低下が誘導されることがわかった (Fig. 1E)。一方で、CTX 処置時には、24 時
間で 70%程度まで ATP レベルが低下したが、急激な ATP レベルの低下は認められなかっ
た (Fig. 1F)。次に、細胞死に伴う細胞膜破裂により細胞外へ放出されるタンパク質の１つ
である乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH, Lactate dehydrogenase)27 の培養上清への放出量を測定す
ることにより、細胞膜破裂を評価した。その結果、MNNG 処置により LDH 放出が誘導さ
れた一方で、CTX は LDH の放出を誘導しなかった (Fig. 1G)。このことから、MNNG 処置
により活性化した PARP-1 は、急激な ATP 枯渇を惹起し、細胞膜破裂を伴うネクロティッ
クな細胞死を誘導するのに対し、CTX 依存的に活性化した PARP-1 は、急激な ATP 枯渇お
9
よび細胞膜破裂を伴わない細胞死を誘導することがわかった。CTX によるパータナトスの
誘導には、p62 依存的に形成されるタンパク質凝集体 ALIS が関与する 1 ため、ALIS 形成が
抑制される p62 欠損細胞は、CTX 誘導性パータナトスに耐性を示す (Fig. 1I)。そこで、
MNNG 誘導性パータナトスに ALIS が関与するか調べるために、p62 欠損細胞において
MNNG 誘導性細胞死を評価した。その結果、p62 欠損細胞は MNNG 誘導性細胞死に耐性を
示さなかった (Fig. 1J)。このことから、MNNG 誘導性パータナトスは ALIS 非依存的に誘導
されることが考えられた。以上の結果から、CTX 処置時に誘導される ALIS 依存的なパー
タナトスは、MNNG 処置時に誘導されるパータナトスとは異なる形態の細胞死であること
が明らかとなった。
10
120
***
***
***
***
B
***
120
***
100
Cell viability
(% of control)
Cell viability
(% of control)
A
80
60
WT
40
PARP-1 KO #1
20
PARP-1 KO #2
***
100
***
60
DMSO
40
Rucaparib
20
0
0
0
0.4
0.6
0.8
1
0
0.4
CTX (mg/mL)
0.6
0.8
1
CTX (mg/mL)
C
D
120
**
100
***
***
***
***
***
***
80
120
60
WT
40
PARP-1 KO #1
20
PARP-1 KO #2
Cell viability
(% of control)
***
Cell viability
(% of control)
***
80
***
100
***
***
80
***
60
DMSO
40
Rucaparib
20
0
0
0
5
10
20
30
0
5
MNNG (μM)
E
20
30
F
***
***
100
120
***
ATP level
(% of control)
120
ATP level
(% of control)
10
MNNG (μM)
80
60
WT
40
PARP-1 KO
20
100
***
80
60
40
20
0
0
0
15
30
60
0
MNNG (min)
G
H
0
24
36
MNNG (h)
48
12
LDH release
(% of positive control)
CTX (h)
24
CTX (h)
PC
80
60
***
40
20
0
0
24
36
48
12
CTX (h) MNNG (h)
I
J
140
120
100
80
***
***
***
***
***
120
WT
60
40
20
0
p62 KO #1
p62 KO #2
Cell viability
(% of control)
Cell viability
(% of control)
***
100
80
N.S.
WT
60
40
N.S.
20
N.S.
N.S.
p62 KO #2
0
0
0.4
0.6
0.8
1
0
CTX (mg/mL)
5
10
MNNG (μM)
Figure 1 CTX は非炎症性の細胞死を誘導する
11
p62 KO #1
20
30
(A) WT or PARP-1 KO HT1080 cells were treated with the indicated concentration of CTX for 36
h, and then subjected to cell viability assay. ...
この論文で使われている画像
